Identificación de un trasportador alternativo a la lactosa permeasa en cepas de Shigella sonnei fermentadoras rápidas de lactosa aisladas en dos brotes de diarrea en Antofagasta y la Región Metropolitana 2008-2009

Abstract

Normalmente las cepas de Shigella sonnei aisladas de gastroenteritis presentan fenotipo de fermentación lenta de la lactosa (luego de 48 h de incubación), consignándose como cepas lactosa negativas; sin embargo, en una colección de cepas de dos brotes de diarrea: Antofagasta y la Región Metropolitana 2008-2009, en los subcultivos correspondientes, se aislaron cepas que presentaron fermentación rápida de lactosa (24 h). Existe el antecedente que en dos genomas secuenciados de S. sonnei (cepas Ss046 y 53G), el gen lacZ está intacto, mientras que el gen lacY, que codifica la lactosa permeasa, está incompleto y presenta una IS1. Por otro lado, en Escherichia coli se han descrito mutaciones en los componentes del sistema transportador de maltosa que amplían su rango de sustratos, permitiendo la incorporación de lactosa por esta vía. Considerando estos antecedentes, el objetivo de esta tesis fue identificar si un transportador alternativo a la lactosa permeasa, como el transportador de maltosa, media el ingreso de la lactosa, en cepas de S. sonnei fermentadoras rápidas de lactosa, aisladas del brote de Antofagasta y la Región Metropolitana 2008-2009. Para ello se caracterizó fenotípicamente la fermentación rápida de la lactosa, evaluando tiempo de fermentación del azúcar, estabilidad del fenotipo, utilización de la lactosa en medio líquido y actividad β-galactosidasa. Por otro lado, se caracterizó molecularmente la integridad del gen lacY mediante PCR-secuenciación. Para determinar la participación del sistema transportador de maltosa en la incorporación de lactosa, se realizó un análisis de secuencia de los genes que codifican para componentes de este sistema, se midieron los niveles de expresión de los genes lamB y malF de una cepa fermentadora rápida representativa de cada brote y ambos genes fueron expresados en forma heteróloga en en la cepa control de S. sonnei ATCC-25931 (fermentación tardía de lactosa, 48-72 h), mediante el vector de expresión, inducible por arabinosa, pBAD24. La expresión de lamB y malF se evaluó en placas de agar Mac Conkey suplementadas con arabinosa y por qPCR. De las 108 cepas de S. sonnei (17 de Antofagasta y 91 de la Región Metropolitana), 56 (51,8%) fueron fermentadoras rápidas, 24 (22,2%) fermentadoras tardías y 28 (25,9%) fueron no fermentadoras de lactosa. Se seleccionaron 10 cepas fermentadoras rápidas representativas de cada brote, las cuales presentaron un fenotipo de fermentación rápida estable, utilización de la lactosa en caldo Mac Conkey, similar al control de S. sonnei ATCC-25931 y actividad β-galactosidasa. En todas las cepas se confirmó la pérdida de la integridad e inserción del elemento IS1 en el gen lacY. El análisis de las secuencias del sistema transportador de maltosa reveló cambios aminoacídicos menores en las cepas fermentadoras rápidas de lactosa, respecto a dos cepas fermentadoras tardías como control. No se observaron diferencias estadísticamente significativas en los niveles de expresión de los genes lamB y malF de las cepas fermentadoras rápidas y la cepa control fermentadora tardía. Las cepas de S. sonnei ATCC-25931 transformadas con los genes lamB y malF no presentaron cambios en el fenotipo de fermentación de la lactosa y el análisis por qPCR reveló un aumento promedio de la expresión de 949 veces del gen lamB y 39 veces del gen malF, en las cepas inducidas con arabinosa, respecto de las cepas no inducidas. Estos resultados en su conjunto, evidencian que en las cepas de S. sonnei fermentadoras rápidas, aisladas de los brotes de Antofagasta y la Región Metropolitana 2008-2009, los genes lamB y malF del sistema transportador de maltosa, no participarían en la internalización de la lactosa, lo cual sugiere que el fenotipo de fermentación rápida en estas cepas involucra otro transportador.

menores en las cepas fermentadoras rápidas de lactosa, respecto a dos cepas fermentadoras tardías como control. No se observaron diferencias estadísticamente significativas en los niveles de expresión de los genes lamB y malF de las cepas fermentadoras rápidas y la cepa control fermentadora tardía. Las cepas de S. sonnei ATCC-25931 transformadas con los genes lamB y malF no presentaron cambios en el fenotipo de fermentación de la lactosa y el análisis por qPCR reveló un aumento promedio de la expresión de 949 veces del gen lamB y 39 veces del gen malF, en las cepas inducidas con arabinosa, respecto de las cepas no inducidas. Estos resultados en su conjunto, evidencian que en las cepas de S. sonnei fermentadoras rápidas, aisladas de los brotes de Antofagasta y la Región Metropolitana 2008-2009, los genes lamB y malF del sistema transportador de maltosa, no participarían en la internalización de la lactosa, lo cual sugiere que el fenotipo de fermentación rápida en estas cepas involucra otro transportador. These results suggest that the maltose transport system is not involved in the internalization of lactose in the fast lactose fermenting strains, implying the participation of an alternative transporter.