Transferencia genética horizontal de ROD21, una isla de patogenicidad inestable presente en el cromosoma de salmonella entérica serovar enteriditis

Abstract

Las bacterias pueden obtener material genético foráneo a través de un proceso denominado transferencia genética horizontal (TGH). Mediante este proceso las bacterias adquieren rápidamente nuevas características que favorecen su supervivencia y es uno de los principales motores en la evolución bacteriana. Uno de los casos donde la TGH ha jugado un rol importante en la generación de diversidad es en el género Salmonella, donde actualmente se han reportado más de 2.500 serovares. Unos de los serovares de importancia en salud humana es el serovar Enteritidis (S. Enteritidis), ya que afecta a un amplio rango de hospedero, incluyendo al hombre y animales de importancia comercial. Elementos genéticos presentes en estas bacterias, como ciertas islas de patogenicidad y profagos, son inestables y por lo tanto son potencialmente transferibles a otras bacterias del medio donde se encuentren. En nuestro laboratorio hemos identificado una isla de patogenicidad inestable en el cromosoma de S. Enteritidis, denominada ROD21. ROD21 posee un tamaño de 26,5 kb y se encuentra en una región que posee tres copias del gen que codifica el tRNA de asparragina (asnT). Esta isla de patogenicidad contiene al gen tlpA, involucrado en la virulencia de la bacteria. En experimentos previos hemos demostrado que la isla ROD21 es capaz de escindirse del cromosoma de S. Enteritidis en medio de cultivo LB. Además, esta capacidad de escisión aumenta cuando la bacteria es sometida a tratamientos con peróxido de hidrógeno, dando indicios de que ciertas condiciones ambientales influyen en la escisión. Para determinar si ROD21 es capaz de transferirse a otras bacterias, se generó una cepa dadora que poseía un gen de resistencia a kanamicina en ROD21 (S. Enteritidis ROD21::aph) y también se generaron cepas receptoras de S. Enteritidis carentes de ROD21 (ΔROD21), S. Typhimurium, E. coli H10407 y E. coli EDL933, las que poseían el gen de resistencia a cloranfenicol inserto río abajo del gen putA. Se realizaron ensayos de transferencia en medio líquido, donde se obtuvo frecuencias de transferencia de 2,2x10-7 por dadora para S. Enteritidis y 3,2x10-8 por dadora para S. Typhimurium. Para E. coli no se obtuvo bacterias que integraran ROD21 en su genoma. Posteriormente, mediante ensayos de transferencia en filtro, se determinó que la movilización de la isla ocurre mediante un proceso conjugativo, obteniendo mayores frecuencias de transferencia que en medio líquido. Además, se descartó que el proceso de transferencia ocurriera por transformación natural o transducción. Finalmente, se analizó el efecto de ciertas condiciones ambientales que pudiesen afectar la transferencia de ROD21, observando que la temperatura y pH logran aumentar la frecuencia de transferencia. Estos datos indican que ROD21 es una isla de patogenicidad inestable capaz de transferirse a otras bacterias mediante conjugación, siendo este un evento especie específico y que es afectado por factores ambientales, que podrían influir tanto en el ciclo natural de la bacteria, como en un proceso infectivo, asegurando la mantención de ROD21 dentro de la población.

Horizontal gene transfer of ROD21: an unstable pathogenicity island present in the chromosome of Salmonella enterica serovar Enteritidis Bacteria can obtain foreign genetic material through a process called horizontal gene transfer (HGT). Through this process, bacteria rapidly acquire new traits that favor their survival and is one of the main drivers in bacterial evolution. One case where HGT has played an important role in the generation of diversity is in the genus Salmonella enterica, where currently more than 2,500 serovars are reported. One of the serovars of importance in human health is serovar Enteritidis (S. Enteritidis), affecting a wide host range, including humans and animals of commercial importance. Genetic elements present in these bacteria, like certain pathogenicity islands and prophages, are unstable and therefore are potentially transferable to other bacteria in the environment. In our laboratory we have identified an unstable pathogenicity island in the chromosome of S. Enteritidis, called ROD21. ROD21 is 26.5 kb in size and is located in a region that has three copies of the gene coding for asparagine tRNA (asnT-tRNA). This pathogenicity island contains the gene tlpA, involved in the virulence of the bacteria. Previous experiments have shown that the island suffers excision from the chromosome of S. Enteritidis in LB medium. In addition, this phenomenon increases when the bacteria is subjected to treatment with hydrogen peroxide, providing evidence that certain environmental conditions would influence the excision event. To determine whether ROD21 is able to transfer to other bacteria, we generated a donor strain that had a kanamycin resistance gene in ROD21 (S. Enteritidis ROD21::aph), and also generated recipient strains of S. Enteritidis lacking ROD21 (ΔROD21), plus S. Typhimurium, E. coli H10407, and E. coli EDL933, which possessed the chloramphenicol resistance gene inserted downstream the putA gene. Transfer assays were performed in liquid medium, which yielded transfer frequencies of 2.2 x10-7 per donor for S. Enteritidis and 3.2 x10-8 per donor for S. Typhimurium. For E. coli, there were no bacteria that integrated ROD21 into their genome. Subsequently, by filter-mating assays, it was determined that the mobilization of the island occurs through a conjugative process, achieving higher transfer frequencies than in liquid medium. Furthermore, we confirmed that the transfer process does not occur by natural transformation or transduction. Finally, we analyzed the effect of certain environmental conditions that could affect ROD21 transfer, and found that the temperature and pH are able to increase the frequency of transfer. These data indicate that ROD21 is an unstable pathogenicity island that can be transferred to other bacteria by conjugation, being a species-specific event that is affected by environmental factors that might influence both the natural cycle of bacteria and the infective process, ensuring the maintenance of ROD21 within the population.