Rol de Klotho en la regulación de la neurogénesis hipocampal del adulto

Abstract

La población mundial envejece en forma acelerada. Considerando que el deterioro cognitivo es uno de los principales determinantes de enfermedad y discapacidad de los adultos mayores, la comprensión de sus mecanismos fisiopatológicos es fundamental para el desarrollo de medidas orientadas a mejorar su prevención, diagnóstico y tratamiento. En el giro dentado del hipocampo existe un fenómeno de plasticidad neuronal llamado neurogénesis del adulto, en el cual células progenitoras residentes en ese nicho proliferan y se diferencian en nuevas neuronas, las que son integradas en los circuitos neuronales existentes, y son relevantes para procesos cognitivos como el aprendizaje y la memoria. La neurogénesis hipocampal del adulto disminuye en forma progresiva con el envejecimiento, y se encuentra alterada en múltiples enfermedades neurodegenerativas asociadas al él. La neurogénesis del adulto es un proceso altamente regulado: tanto factores ambientales como señales del propio nicho neurogénico han demostrado ser importantes reguladores de la mantención, proliferación, y posterior diferenciación hacia estirpe neuronal de las células progenitoras. Klotho es una proteína con efectos antienvejecimiento, expresada principalmente en riñón, pero que ha sido aislada en el hipocampo de ratones adultos. Recientemente fue descrita una asociación entre niveles plasmáticos elevados de klotho y un mejor rendimiento cognitivo en cohortes de humanos adultos. Se ha observado en tejidos no neuronales que klotho participa en múltiples vías de transducción de señales, varias de ellas vinculadas a la regulación de la neurogénesis del adulto, y estudios realizados en el ratón deficiente de klotho han mostrado que la ausencia del gen correlaciona con un aumento en la tasa de proliferación de células progenitoras en múltiples nichos como medula ósea y vellosidades intestinales. Considerando que: 1) klotho se expresa en el hipocampo, 2) que participa en vías de transducción de señales asociadas a la regulación de la neurgénesis del adulto, y 3) que en tejidos no neuronales ha mostrado regular la tasa de proliferación de células progenitoras, se plantea la siguiente hipótesis: klotho es un inhibidor de la neurogénesis hipocampal del adulto. En esta tesis, mediante PCR, Western blot, inmunohistoquímica e inmunofluorescencia se caracterizó la expresión de klotho en la región granular del giro dentado del hipocampo de ratones adultos, encontrándose que la expresión de klotho se concentra principalmente en las capas 2 y 3 de la región granular del giro dentado. Mediante inmunofluorescencia en cultivos primarios de neuronas hipocampales se evidenció la expresión de klotho en células neuronales, y mediante rtPCR se mostró que no existe un cambio en la expresión hipocampal del gen klotho asociado al envejecimiento de los ratones. Utilizando como modelo ratones deficientes de klotho, mediante inmunofluorescencia, se encontró un mayor numero células Ki67 y doblecortina (Dcx) positivas en la región subgranular del hipocampo de los ratones deficientes de klotho comparado con controles silvestres, lo que es compatible con un aumento en la neurogénesis hipocampal en ausencia de expresión del gen klotho, y con la hipótesis planteada en esta tesis. Considerando la expresión de klotho en múltiples tejidos, y que se trata de un factor circulante, se estudió el efecto de la inhibición local de la expresión de klotho en el hipocampo. Para ello se produjeron vectores lentivirales que expresan shRNA capaces de inhibir la expresión del gen klotho, los que fueron inyectados mediante cirugía estereotáxica en el giro dentado de ratones adultos. Los hipocampos infectados con shRNA-antiklotho mostraron un menor número de células Ki67 y dcx positivas en la región subgranular del giro dentado, lo que es compatible con una menor neurogénesis en hipocampos deficientes del gen klotho, dato opuesto al observado en el ratón deficiente de klotho. Adicionalmente cultivos de progenitores hipocampales de ratón adulto fueron estimulados con la proteína klotho recombinante, lo que produjo un aumento en la tasa de proliferación de dichas células, resultado concordante con la interferencia local de klotho en el hipocampo. En conjunto, estos resultados demuestran que klotho participa de la regulación de la neurogénesis hipocampal del adulto. Los datos de modulación local de la expresión del gen klotho, y de estimulación directa de progenitores hipocampales de ratón adulto, son compatibles con que la expresión hipocampal de klotho estimularía la proliferación de progenitores hipocampales en ratones adultos. Las diferencias encontradas en el efecto sobre la neurogénesis entre el ratón deficiente de klotho y la interferencia local de klotho en el hipocampo pueden explicarse por diferencias entre los modelos -como la temporalidad y/o la intensidad de dicha inhibición- o a la participación de mediadores entre la expresión sistémica de klotho y su efecto sobre los progenitores, los que no se verían alterados en el modelo de interferencia local. Los datos obtenidos en esta tesis permiten establecer un rol funcional para la expresión hipocampal de klotho en la regulación de la neurogénesis hipocampal del adulto, contribuyendo así con la caracterización de un nuevo regulador de dicho proceso, no descrito previamente. Estos resultados, muestran un rol de klotho en la fisiología normal de la neurogénesis del adulto, abriendo un espacio para el estudio de su rol en el proceso del envejecimiento o condiciones patológicas.

The world population is aging at an accelerated rate. As cognitive impairment is one of the main determinants of disease and disability among the elderly, understanding its pathophysiological mechanisms is essential for the development of measures to improve its prevention, diagnosis and treatment. In the dentate gyrus of the hippocampus occurs a neuroplasticity phenomenon called adult hippocampal neurogenesis, where stem cells resident in that niche proliferate and differentiate into new neurons. These new cells are integrated into existing neural circuits, and are relevant for cognitive functions such as learning and memory. Adult hippocampal neurogenesis decreases progressively with age, and is altered in many neurodegenerative diseases associated with it. Adult neurogenesis is a highly regulated process: both environmental factors and signals from the neurogenic niche itself have shown to be important regulators of the maintenance, proliferation and subsequent differentiation into neuronal lineage of progenitor cells. Klotho is a protein with anti-aging effects, mainly expressed in the kidney, but is also isolated from the hippocampus of adult mice. An association between elevated Klotho plasma levels and a better cognitive performance was recently described in adult human cohorts. In non-neuronal tissues Klotho is involved in several signaling pathways, many of them linked to the regulation of adult neurogenesis. Studies in klotho knockout (KO) mice have shown that the absence of the gene correlates with an increased proliferation rate of progenitor cells in multiple niches, such as bone marrow and intestinal villi. Considering that: 1) Klotho is expressed in the hippocampus, 2) It is involved in signal transduction pathways associated with the regulation of adult neurgenesis, and 3) that in non-neuronal tissues klotho has been shown to regulate the rate of proliferation of progenitor cells, we propose that Klotho is an inhibitor of adult hippocampal neurogenesis. In this thesis, using PCR, Western blot, immunohistochemistry and immunofluorescence, we describe that expression of Klotho was observed in the granular region of the dentate gyrus of the hippocampus of adult mice, mainly concentrated in layers 2 and 3 of the granular layer and was almost absent in the subgranular zone where progenitor cells reside. By immunofluorescence in primary cultures of hippocampal neurons Klotho expression in neuronal cells was evident, and by rtPCR we shown that there is no change in hippocampal Klotho gene expression associated with aging of the mice. Using as a model the klotho knockout mice, and immunofluorescence, we found more Ki67 and doublecortin (DCX) positive cells in the subgranular zone of the hippocampal region of the klotho KO mice compared to wild-type controls, which is consistent with an increased adult hippocampal neurogenesis in the absence of Klotho expression, and with our hypothesis of an inhibitor role klotho on neurogenesis. However, considering that Klotho expression can be found in several tissues, and that klotho is a circulating factor, we decided to study the local effect of inhibition of Klotho expression in the hippocampus. We produced lentiviral vectors expressing shRNA capable of inhibiting Klotho gene expression. These lentiviral vectors were injected by stereotaxic surgery in the dentate gyrus of adult mice. ShRNA-infected antiklotho hippocampus showed a smaller number of Ki67 and DCX positive cells in the subgranular zone of the dentate gyrus compared with scrambled infected controls, suggesting that local deficiency of klotho induces lower hippocampal neurogenesis, opposite to what was observed in the Klotho KO mice, which represents a systemic deficiency of klotho. Additionally cultures of neuronal progenitors cells from adult mice hippocampus were stimulated with the recombinant Klotho protein, resulting in an increase in the proliferation rate of such cells, a result consistent with Klotho’s local interference in the hippocampus. Together these results demonstrate that Klotho is expressed in the adult hippocampus of mice and participates in the regulation of adult hippocampal neurogenesis by regulating the proliferation rate of neuronal progenitor cells. The differences in the effect on neurogenesis between Klotho KO mice and Klotho local interference in the hippocampus may be explained by differences between models such as the timing and / or intensity of such inhibition or the participation of mediators between systemic Klotho expression and its effect on target tissues, which would not be altered in the model of local interference. The data obtained in this thesis establish a new functional role for hippocampal Klotho expression in regulating adult hippocampal neurogenesis, thus contributing to the characterization of a new regulator of this process, not described previously. These results show a role of Klotho in normal physiology of adult neurogenesis, opening a new field for the study of its role in the process of aging and pathological conditions.