Expresión de una proteína de fusión para la producción de proteína unicelular rica en metionina en Trichoderma reesei (RUT C30)

Abstract

La Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO) proyecta que la demanda de proteínas aumentará un 70% para el año 2050, lo cual traerá consigo un aumento en los requerimientos de alimento para animales. En el caso particular de Chile, esto afecta directamente a la industria del salmón, donde la harina de pescado es ampliamente utilizada para la alimentación de peces carnívoros como el salmón. Esto se suma a que se prevé que en los próximos años habrá poca disponibilidad de este alimento y que, además, experimentará un decaimiento de su calidad. Es por eso, que se hace necesaria la búsqueda de nuevas fuentes de proteínas para la alimentación de salmones que cumplan con sus requerimientos nutricionales y que sea amigable con el medio ambiente. Una buena alternativa es la proteína a partir de hongos unicelulares, que tiene la ventaja de tener un bajo contenido de ácidos nucleicos y alto contenido de proteínas. Por ejemplo, Trichoderma sp es un género de hongos filamentosos que posee un alto contenido proteico y es considerado un organismo Generally Regarded as Safe (GRAS) lo que lo convierte en una buena alternativa para estos fines. Sin embargo, no cumple con los requerimientos nutricionales para salmones, por su bajo contenido de metionina. En esta tesis nos basamos en estrategias previas de aumento del contenido de metionina en hongos y vegetales, como es la expresión recombinante proteínas vegetales de almacenamiento y en proteínas formadoras de cuerpos de proteínas para generar dos proteínas de fusión entre proteínas formadoras de cuerpos de proteínas (Zera y HFB1) y una proteína de rica en metionina (AmA1). Se transformó Trichoderma reesei RUTC30 con ambas construcciones de fusión mediante transformación de protoplastos. Se obtuvieron transformantes para ambas proteínas de fusión, las que fueron validadas mediante secuenciación de amplicones y Western Blot. Sin embargo, las transformantes obtenidas presentan un fenotipo distinto al parental, no esporulan y tienen un menor crecimiento.

FAO predicts that the demand for protein will increase by 70% by 2050, which will bring also an increase in the demand for animal feed. Fishmeal is widely used to feed carnivorous fish such as salmon, which is one of the most important industries in Chile. However, it is expected that there will be a decrease in the availability and quality of fishmeal products in the next years. It is necessary to search for new sources of protein for animal feed, which meet their nutritional requirements and that are sustainable in the future. Fungal single cell protein is a good source of alternative proteins, which has the advantage of being low in nucleic acids and high in protein. For example, Trichoderma sp. is a genus of filamentous fungi that has a high protein content and is Generally Regarded as Safe (GRAS), which makes it a great alternative for these purposes. However, it does not meet the nutritional requirements of salmon, specifically due to its methionine content. In this work, we have based on previous strategies to increase the methionine content in fungi and plants, such as the recombinant expression of plant storage proteins and protein-body forming proteins. We generated two fusion proteins between a protein body-forming protein (Zera and HFB1) and a methionine-rich protein (AmA1). The fusion constructs were delivered into Trichoderma reesei RUTC30 nucleus by protoplast transformation. Transformants were obtained for both fusion proteins and validated by amplicon sequencing and Western Blot. However, the transformants present a different phenotype from the parental strain, since they do not sporulate and have a slower growth rate.