Estudio del efecto de las condiciones de crecimiento y del medio de cultivo sobre la producción de xilanasa recombinante en Pichia Pastoris y diseño de un modelo matemático para estimar la producción de la enzima en metanol

Abstract

La endo-1,4-β-xilanasa es una enzima que cataliza la hidrólisis del xilano, liberando xilosa y xilooligosacáridos (XOS), oligosacáridos compuestos por 2 a 10 monómeros y los estudios sobre su producción han ido en aumento por su carácter prebiótico. Entre los beneficios de su consumo se encuentra el fortalecimiento del sistema inmunológico. La producción suele ser de 2 etapas, un pretratamiento y una hidrólisis enzimática. Por esto es de interés el diseño de un sistema de producción en una etapa, así surge la implementación de un sistema in situ. Entre las ventajas de este sistema están la reducción de pasos y disminución de costos. Sin embargo, las condiciones óptimas de crecimiento difieren de las usadas en la hidrólisis enzimática, por lo que es importante identificar estas condiciones para el sistema in situ. Además, es de interés diseñar un modelo matemático para predecir la producción de la enzima a partir de las reacciones metabólicas de P. pastoris. Entonces, la tesis tiene como objetivo principal estudiar el efecto de distintos factores y de los componentes del medio de cultivo sobre la producción de xilanasa recombinante en Pichia pastoris y diseñar un modelo matemático que estime la producción de la enzima en metanol. La metodología general fue estudiar el efecto del pH, temperatura, concentración de metanol y tipo de buffer sobre la actividad xilanasa GtXyn10A. Luego, estudiar el crecimiento de P. pastoris y la producción de la enzima por parte del mismo, usando condiciones apropiadas para la actividad enzimática. Después, se hace un Análisis de Flujos Metabólicos, con 69 reacciones que participan en la síntesis, usando solver de Microsoft Excel. Posteriormente se construye el modelo matemático realizando un Análisis de Balance de Flujos en Cobrapy. Entre los principales resultados se encontró que usar metanol al 1%, a pH 6 y a 30°C pueden ser usados para el diseño del sistema in situ. También, se propone reemplazar el buffer fosfato y el YNB (Yeast Nitrogen Base) por buffer citrato y casaminoácidos respectivamente ya que fueron identificados como inhibidores fuertes. Se proponen 3 nuevos medios de cultivos de los cuales el MM* cit destacó por triplicar la productividad específica (1,38 [U/g*h]) durante las primeras 24 [h] de cultivo en relación al medio BMMY (0,46 [U/g*h]). En cuanto al modelo matemático, se logró establecer la reacción de síntesis de xilanasa recombinante, del cual se obtuvo una producción de 6,12 [g MetOH/g Xyl]. Además, el modelo matemático estimó una producción de 144,2 [mg Xyl/L], valor que se asemeja a la producción experimental obtenida (90,4 [mg Xyl/L]). La diferencia se atribuye principalmente a que Cobrapy es un optimizador, pudiendo sobreestimar la producción experimental. Como proyecciones se tienen: estudiar el efecto que tiene la xilosa sobre la producción de la xilanasa recombinante, implementar el sistema in situ usando el medio MM* cit a 30°C y pH 6 y estudiar los rangos de concentración de metanol al que el modelo se ajusta correctamente.