Efecto de las levaduras Debaryomyces hanssnii 97 y Yarrowia lipolytica 242 en la motilidad del patógeno Vibrio anguillarum.

Abstract

El interés por el uso de probióticos en la acuicultura ha aumentado en los últimos años. Dentro de los beneficios que otorgan se encuentra la protección del hospedero de infecciones bacterianas. Las cepas Debaryomyces hansenii 97 y Yarrowia lipolytica 242 son levaduras probióticas capaces de proteger a larvas de pez cebra (Danio rerio) contra la infección causada por Vibrio anguillarum. Uno de los mecanismos patogénicos de esta bacteria es su motilidad, que es necesaria en las etapas iniciales de la infección. En esta tesis se investigó si estas levaduras eran capaces de disminuir la motilidad del patógeno. Se realizó una mini revisión de las técnicas disponibles para evaluar la motilidad bacteriana, enfatizando en técnicas óptimas para estudios relacionados a la interacción de la bacteria con un hospedero. En el laboratorio, se tiñó V. anguillarum PF4 con el fluoróforo 5-(4,6-diclorotriazin-2-il) aminofluoresceína (DTAF) para observar su distribución y motilidad in vivo en larvas de pez cebra. A pesar de que un bajo porcentaje de bacterias fue marcado con DTAF, se logró observar al patógeno dentro del tracto digestivo del pez. Sin embargo, no se logró visualizar la motilidad bacteriana debido, en parte, a la baja resolución del microscopio utilizado. Por ello, se optó por un ensayo de motilidad in vitro. El protocolo optimizado consistió en inocular una gota de un cultivo del patógeno sobre placas con agar blando (0,36 %) suplementado con un 13 % de sobrenadante libre de células de un cultivo de 18 h de cada levadura. Se midió el diámetro del halo luego de 18 y 22 h de incubación. Los resultados mostraron que ninguna de las levaduras afectó el diámetro del halo patógeno. Así, la capacidad de estas levaduras de mitigar la infección de V. anguillarum en pez cebra no parece relacionarse con una disminución en la motilidad de la bacteria. Considerando las limitaciones de la metodología empleada, se sugiere realizar estudios adicionales para descartar que haya un efecto en la motilidad in vivo

Interest in using probiotics in aquaculture has increased in the last years. Among the benefits they confer, one is protection of the host against bacterial infections. Debaryomyces hansenii 97 and Yarrowia lipolytica 242 are probiotic yeast strains capable of protecting zebrafish (Danio rerio) larvae against Vibrio anguillarum infections. One of the pathogenic traits of this bacteria is its motility, which is required in the early stages of the infective process. Here, we investigated whether these strains could diminish this pathogen’s motility. We elaborated a mini review about the available techniques for the study of bacterial motility, highlighting the optimal techniques for host-related studies. In the laboratory, V. anguillarum PF4 was stained with the fluorophore 5-(4,6-dichlorotriazinyl) aminofluorescein (DTAF) to observe in vivo motility and distribution inside zebrafish larvae. Although a low percentage of bacteria was stained with DTAF, it was still possible to observe the pathogen inside the zebrafish digestive tract. Nevertheless, it was not possible to visualize bacterial motility, partially due to the low resolution of the microscope used. Because of this, an in vitro motility assay was performed. The optimized protocol consisted in inoculating a drop of the pathogen’s culture on top of soft agar plates (0,36 %) supplemented with 13 % of cell-free supernatant of a 18 h culture of each yeast. The halo diameter was measured after 18 and 22 h of incubation. Our results showed that neither of the yeast strains modified the pathogen’s halo diameter. Therefore, the capacity of these strains to mitigate a V. anguillarum infection in zebrafish does not seem to be related to a reduction in the motility of this bacteria. Considering methodological limitations, performing additional experiments to rule out an in vivo effect in bacterial motility is suggested.