Evaluación de estrés por frío y cobre durante la formación de biopelícula de Listeria monocytogenes

Abstract

Listeria monocytogenes es un patógeno transmitido por alimentos, causante de listeriosis. L. monocytogenes resiste diversos factores de estrés que se utilizan en la industria de los alimentos para evitar la contaminación y proliferación bacteriana, entre estos el frío. El cobre (Cu) es un metal que posee propiedades antimicrobianas y podría ser útil para control este patógeno. Se ha reportado que cultivos de L. monocytogenes suplementados con concentraciones subletales de Cu reducen su velocidad de crecimiento cuando se exponen a 8°C en comparación con su crecimiento a 37°C. L. monocytogenes se adhiere a superficies y forma biopelículas (Bp), lo cual le permite persistir en equipamientos utilizados en la industria alimenticia. Los estudios han demostrado que existen genes clave para la formación de Bp. Objetivo: Relacionar la presencia y la respuesta transcripcional de genes asociados a la formación de biopelícula en aislados de L. monocytogenes con su capacidad de formar biopelícula en frío y cobre. Métodos: Se llevó a cabo una exhaustiva búsqueda bibliográfica para identificar genes relacionados a la formación de Bp en L. monocytogenes. Luego, los genes identificados fueron buscados en el genoma de 422 aislados de L. monocytogenes proveniente de distintos orígenes de aislamiento (ambiente, clínica, alimentos y aguas) mediante el software Ridom Seqsphere+. Se analizaron los genomas según la presencia/ ausencia de los genes y se escogieron 18 aislados pertenecientes a cuatro grupos (A-D) con diferentes perfiles de genes. Se evalúo la capacidad de formación de Bp de los aislados en 4 condiciones: 37ºC, 8ºC, 37ºC+Cu (0,5 mM) y 8ºC +Cu (0,5 mM). La cantidad de Bp fue determinada luego de 48 hrs mediante el método de tinción con cristal violeta. Resultados: Se identificaron 119 genes relacionados a la formación de Bp, los cuales fueron divididos en 2 categorías: genes directamente relacionados a Bp (n=20) y genes indirectamente relacionados a la formación de Bp (n=99), cuya función específica se relaciona con otros procesos celulares, pero que la evidencia indica que la perdida de funcionalidad de dicha proteína afecta la formación de Bp. Los genes directamente relacionados a Bp están altamente conservados en los genomas de L. monocytogenes; sin embargo, la presencia de los genes indirectamente relacionados a Bp en los genomas de L. monocytogenes varió. Todos los aislados mostraron capacidad de formar Bp en las cuatro condiciones evaluadas. La cantidad de Bp no cambió significativamente cuando L. monocytogenes fue expuesta a 8°C o Cu respecto a lo observado a 37°C. Sin embargo, la exposición de L. monocytogenes a 8°C y Cu simultáneamente mostró un aumento en la formación de Bp en comparación con la formación de Bp a 37°C. La capacidad de formación de biopelículas, a 37°C y frente a los factores de estrés evaluados, fue independiente de la presencia de genes y la capacidad de formación de estas estructuras. Tampoco se observó una relación entre la formación de Bp y el serogrupo. Es necesario evaluar la regulación de la respuesta transcripcional de estos genes para comprender la diferencia observada en el nivel de producción de Bp en condiciones de estrés.

Background: L. monocytogenes is a foodborne pathogen that causes listeriosis. Lm resist many stresses used in food processing environments to avoid bacterial growth as low temperature. Copper (Cu) is a metal with antimicrobial properties, and it may be useful to control this pathogen. Previously has been reported that L. monocyogenes cultures supplemented with sublethal Cu concentrations were less viable when growing at 8°C than when cultured at 37ºC. L. monocyogenes can adhere and form biofilms (Bf) in different materials. This determines the pathogen ability to persist in equipment and environments in the food industry. Studies have shown that there are key genes for the Bf-formation. Aims: To relate the presence of Bf-associated genes in the genome of L. monocyogenes isolates with their ability to form Bf in cold and copper. Methods: An exhaustive bibliographic search was performed to identify L. monocyogenes Bf-related genes. Then, a local database of 422 L. monocyogenes genomes from different sources (water, foods, food processing environments and clinical) was analyzed to identify the presence of Bf-related genes using Ridom SeqSphere+ software. L. monocyogenes genomes were clustered according to the presence or absence of genes and 18 isolates belonging to four groups (A-D) with different gene profiles were chosen for further assays. The Bf-forming capacity of the isolates was evaluated under the following conditions: 37ºC, 8ºC, 37ºC+Cu (0,5 mM) and 8ºC +Cu (0,5 mM). The Bf was quantified after 48 hrs using a crystal violet stain. Results: 119 genes related to the formation of Bf were identified, which were divided into 2 categories, genes directly related to Bf (n = 20) and genes indirectly related to Bf formation (n = 99) whose specific function is related to other cellular processes, but the evidence indicates that the loss of functionality the correlating protein affects the formation of Bf. Genes directly related to Bf were highly conserved in L. monocyogenes genomes. All isolates showed the ability to form Bf under all four evaluated conditions. The Bf levels did not change significantly when L. monocyogenes was exposed to 8°C and Cu separately compared to the control (37 ° C). The presence of Cu at 8ºC significantly increased the Bf formation reaching higher levels than 37ºC. The biofilm formation capacity, at 37°C and against the evaluated stress factors, was independent of the presence of genes and the formation capacity of these structures. Neither was a observed a relationship between Bf-formation and the serogroup. It is necessary to evaluate the regulation of transcriptional response of these genes to understand the difference observed in the level of Bf production under stress conditions.