Función del receptor de ryanodina en la contracción de células musculares lisas de venas pulmonares pequeñas de ratas

Abstract

Antecedentes: Los mecanismos contráctiles que involucran regulación de Calcio (Ca2+) no están del todo comprendidos en las células musculares lisas (SMC) de venas intrapulmonares pequeñas (VIP). Problema: Estudios de venocontricción mediada por agonistas fisiológicos (ATP) no han logrado detectar la participación del canal receptor de Ryanodina (RyR), sin embargo, postulamos que el RyR si participa en la contracción de VIP de una manera estímulo dependiente. Objetivo: Evaluar la función de RyR en la contracción de células musculares lisas de VIP de ratas medida por despolarización y agonistas de receptores acoplados a proteína G. Metodología: Se utilizaron rebanadas de pulmón de rata Sprague-Dawley (~300g) y mediante videomicroscopía de contraste de fase se cuantificó la contracción de VIP en respuesta a dos agonistas del RyR: cafeína y 4-CmC. También, se comparó la contracción inducida por KCl, ATP y ADP en presencia y ausencia de dos antagonistas del receptor: dantroleno y ryanodina. Los datos fueron expresados en medianas y rangos intercuartílicos. Se aplicó prueba de Mann- Whitney para comparar dos grupos no pareados y test de Friedman para comparar más de dos grupos pareados. Además se usó F-test para comparar dos curvas ajustadas. En el caso de no lograr un ajuste adecuado, se utilizó el cálculo de área bajo la curva (AUC). Se consideró significativo un valor de p < 0,05. El protocolo fue aprobado por el CICUA de Universidad de Chile (CBA#1044 FMUCH). Resultados La estimulación de VIP con cafeína 20 mM generó una contracción de 41,4% (18,3- 48,8) sólo en el 50% de los vasos. La aplicación de cafeína 40 mM incrementó a 59% las venas que no respondieron, mientras que el 41% restante presentó contracción isotónica. La respuesta contráctil producida por 4-CmC 2 mM fue de 72% (51,9- 100) en el 100% de los vasos. La aplicación de dantroleno y ryanodina, dos inhibidores del RyR, generaron inhibición completa de la respuesta generada por 4-CmC 2 mM. Respecto al mecanismo de participación del RyR, se encontró que dantroleno no modificó la respuesta contráctil inducida por despolarización ni por ATP, pero si inhibió parcialmente la contracción inducida por ADP. Por otra parte, el uso de ryanodina disminuyó tanto la respuesta contráctil generada por despolarización como por los dos agonistas de receptores acoplados a proteína G utilizados. Al comparar los efectos de dantroleno y ryanodina en la contracción inducida por 1mM ADP, se encontró que la inhibición parcial fue similar independiente del antagonista utilizado. Conclusión: RyR es funcional en VIP de ratas y participa contribuyendo la contracción inducida por despolarización como por la vía asociada a proteína G. Los resultados orientan a que RyR2 sería la isoforma más importante en la contracción inducida por despolarización, mientras que RyR1 y RyR3 participarían mayormente en el mecanismo contráctil inducido por agonistas de receptores acoplados a proteína Gq.

Background: Contraction mechanisms of smooth muscle cells (SMC) of intra pulmonary veins (IPV) that involve calcium regulation (Ca2+) are not fully understood. Problem: venoconstriction studies mediated by physiological agonists such as ATP have failed to demonstrate the participation of Ryanodine receptors (RyR), however, we postulate that RyR does participate in IPV contraction in a stimulus dependent manner. Objective: To assess the role of RyR in rat IPV smooth muscle cell contraction as measured by induced depolarization and G protein-coupled receptor agonists stimulation. Methodology: Slices of Sprague-Dawley rat lung (~ 300g) were used and IPV contraction was quantified by phase contrast video microscopy in response to two RyR agonists: caffeine and 4-CmC. Also, the contraction induced by KCl, ATP and ADP in presence and absence of two RyR receptor antagonists: dantrolene and ryanodine was compared. Data was expressed as medians and interquartile ranges. Mann-Whitney test was applied to compare two unpaired groups and Friedman test to compare more than two paired groups. Furthermore, F-test was used to compare two fitted curves. Unfitted curves were analyzed by area under the curve (AUC). A value of p <0.05 was considered significant. Animal protocol was approved by the IACUC of Universidad de Chile (CBA # 1044 FMUCH). Results: The stimulation of IPV with 20 mM caffeine generated a contraction of 41.4% (18.3 - 48.8) only in 50% of the vessels (n = 6 exps. / 5 rats). The stimulation with 40mM caffeine increased the veins that did not respond to 59%, while the remaining 41% showed isotonic contraction. The contractile response induced by of 4-CmC at 2 mM was 72% (51,9-100) in 100% of the vessels. Complete inhibition of the response generated by 2 mM 4-CmC was achieved by the application of dantrolene and ryanodine. Regarding the associated mechanism of RyR, it was found that dantrolene did not modify the contractile response induced by depolarization or by ATP, but it did generate changes in the contraction induced by ADP. The use of ryanodine decreased both the contractile response generated by depolarization as by the two G protein-coupled receptor agonists used previously. When comparing the effects of dantrolene and ryanodine on 1mM ADP-induced contraction, partial inhibition was found to be similar regardless of the antagonist used. Conclusion: RyR is functional in rat IPV and participates by enhancing depolarization-induced contraction as well as by G protein-associated pathway. The results indicate that RyR2 would be the most relevant isoform in IPV contraction induced by depolarization, while RyR1 and RyR3 would participate largely in the contractile mechanism induced by Gq protein-coupled receptor agonists.