Estudio de la dinámica de interacción entre Dictyostelium discoideum y Klebsiella pneumoniae mediante microscopía automática de fluorescencia.

Abstract

Según la evidencia existente, las cepas virulentas del patógeno bacteriano Klebsiella pneumoniae presentan mecanismos de evasión del sistema inmune innato incluyendo una alta resistencia a la fagocitosis por los macrófagos, la que también se manifiesta frente al fagocito modelo Dictyostelium discoideum. Por otro lado, reportes previos indican que células del sistema inmune innato de mamíferos tales como los neutrófilos, producen trampas extracelulares de DNA (NETs, neutrophil extracellular traps o TEDs, trampas extracelulares de DNA) en respuesta a la infección con bacterias, las cuales tienen un efecto antimicrobiano. Recientemente, se observó que células con función inmune llamadas “centinela (S)” presentes en la fase babosa del desarrollo social de D. discoideum, tendrían la capacidad de producir redes de DNA similares a las NETs en respuesta a la infección. No obstante, se desconoce si las células en estado vegetativo de esta ameba tendrían la capacidad de formar dichas redes. Más aún, la resistencia a la fagocitosis, la formación de redes de DNA y otros posibles fenómenos que ocurren en el contexto de la interacción entre ambos organismos han sido estudiadas de manera aislada y mediante mediciones en intervalos espaciados de tiempo, impidiendo la observación directa de la dinámica con la que ocurren estos procesos en escalas de tiempo de minutos a horas. En el presente seminario de título se estudió la interacción entre D. discoideum y distintas cepas de K. pneumoniae, en ensayos cinéticos de microscopía automatizada bajo condiciones ambientales controladas. Específicamente, se evaluó la resistencia a la fagocitosis de las cepas bacterianas, y la posible formación de redes de DNA por parte de D. discoideum ante la presencia de bacterias u otros estímulos. De esta manera, validamos el uso de microscopía automatizada para evidenciar la resistencia a la fagocitosis de la cepa virulenta K. pneumoniae RYC492. Además, demostramos que células vegetativas de D. discoideum forman TEDs en presencia de bacterias, frente al inductor de NETs en neutrófilos PMA, o inclusive en ausencia de los mencionados estímulos. Finalmente, gracias al uso del sistema de microfluídica CellASIC ONIX2, fue posible capturar imágenes y videos con alta resolución de la dinámica de interacción entre D. discoideum y K. pneumoniae y la producción de TEDs, obteniendo detalles de este fenómeno no reportado previamente en la literatura.

According to the existing evidence, virulent strains of the bacterial pathogen Klebsiella pneumoniae exhibit different mechanisms for evading the innate immune system, including a high resistance to phagocytosis by professional phagocytes, including mammalian macrophages and the model amoeba Dictyostelium discoideum. On the other hand, previous reports indicate that mammals' innate immune cells, such as neutrophils, produce extracellular DNA traps (NETs) in response to bacterial infections, which have antimicrobial effects. Furthermore, a recent study revealed that sentinel (S) cells, which have an immune function in the D. discoideum slug phase, produce extracellular DNA traps (ETs) similar to NETs in response to infection. Nevertheless, it is unknown if vegetative cells of this amoeba, prior to differentiation into S-cells, can produce ETs. Moreover, the phagocytosis resistance, ETs production, and other possible phenomena occurring during the interaction between both organisms have been scarcely studied, taking measurements at spaced time intervals, hampering the direct observation of this process’s dynamics in a time frame of minutes to hours. In this context, this work monitored the interaction between D. discoideum and different bacterial strains in kinetic assays using automated microscopy under controlled environmental conditions. Specifically, we evaluated the phagocytosis resistance of the bacterial strains and the possible production of extracellular DNA traps by D. discoideum in response to different stimuli. In this way, we validated the use of automated microscopy to evidence the resistance to phagocytosis of the virulent strain K. pneumoniae RYC492. Furthermore, we demonstrated that vegetative D. discoideum cells form ETs in the presence of bacteria, upon the addition of PMA (an inducer of NETs in neutrophils), or even in the absence of the mentioned stimuli. Finally, by using the CellASIC ONIX2 microfluidic system, we captured high-resolution images and videos of the interaction dynamics between D. discoideum and K. pneumoniae and the production of ETs, obtaining insightful details of this phenomenon not previously reported in the literature.