Bacterias de la microbiota intestinal presente en niños con infecciones por e. coli diarreogénicas modulan la expresión de factores virulencia de eaec y stec y la respuesta inflamatoria inducida sobre células intestinales

Abstract

Las cepas de Escherichia coli diarreogénicas (ECD) son importantes agentes etiológicos de diarrea en niños menores de 5 años. La capacidad de las cepas de ECD para colonizar el epitelio intestinal se relaciona con la expresión de factores de virulencia en el sitio de infección, un proceso altamente regulado y dependiente de la interacción del patógeno con su ambiente en el hospedero. A nivel intestinal, estos patógenos se encuentran con las bacterias de la microbiota y los metabolitos que éstas producen, que en condiciones de una microbiota saludable, son responsables de generar un ambiente que previene la colonización por patógenos entéricos. Sin embargo, estudios recientes demuestran que ciertas especies bacterianas de la microbiota intestinal pueden inducir un aumento en la expresión de genes de virulencia en cepas de ECD y favorecer el proceso infeccioso. Considerando estos antecedentes, en este trabajo se propuso como hipótesis que “Bacterias de la microbiota intestinal de niños con infecciones por E. coli diarreogénicas, inducen un aumento de la expresión de factores de virulencia de cepas de EAEC y STEC y la respuesta inflamatoria generada por estos patógenos sobre células intestinales en cultivo”. Para responder a esta hipótesis, se determinó la composición de la microbiota intestinal de niños entre 1 y 5 años agrupados en tres poblaciones: niños sanos (grupo Control), niños que presentan infecciones por ECD (grupo ECD) y niños que presentan infecciones por virus entéricos (grupo Virus). Para esto, se extrajo el ADN de muestras de deposición de niños pertenecientes a estos grupos y luego se amplificó y secuenció la región R1-R4 del gen que codifica el ARN ribosomal 16S. Con estas secuencias, se realizó un estudio bioinformático que permitió caracterizar la microbiota asociada a cada grupo de estudio. Este análisis mostró que en el grupo ECD existe un aumento de las bacterias pertenecientes al phylum Proteobacteria y una disminución de aquellas pertenecientes al phylum Firmicutes. Adicionalmente, un análisis de redundancia mostró que las muestras de este estudio se agrupan en comunidades de acuerdo al grupo al que pertenecen (Control, ECD o Virus), obteniendo diferencias significativas entre ellos. Finalmente, se identificaron 8 especies bacterianas, denominadas cepas indicadores, que se encuentraron significativamente asociadas al grupo ECD en relación a los otros grupos. Se seleccionaron las 2 especies indicadoras cultivables con mayor significancia estadística, Escherichia albertii (E. albertii) y Citrobacter werkmanii (C. werkmanii), para estudiar el efecto que tienen sobre la virulencia de 2 patotipos de ECD: E. coli productor de toxina Shiga (STEC) y E. coli enteroagregativa (EAEC). Al evaluar la inducción de la secreción de IL-8 de las especies indicadoras, se encontró que E. albertii, a diferencia de C. werkmanii, no induce la secreción de IL-8 sobre células intestinales, mostrando niveles similares a los observados en células sin infectar, de manera que se continuó trabajando sólo con E. albertii. Se evaluó el efecto de E. albertii y del sobrenadante obtenido luego del cultivo de esta bacteria en (i) el crecimiento de STEC y EAEC, (ii) la adhesión de las 2 cepas ECD a células en cultivo y (iii) en la inducción de secreción de IL-8 de las cepas ECD sobre células intestinales. Se encontró que la infección de células intestinales con STEC o EAEC en presencia del sobrenadante de E. albertii, produce un aumento significativo en la secreción de IL-8 comparado a la condición control. En vista de estos resultados, se analizaron los cambios en la expresión génica de las cepas de ECD luego de ser incubadas con el sobrenadante de E. albertii, mediante la técnica de secuenciación de ARN (RNA-Seq), observando cambios en la expresión de factores de virulencia para EAEC y STEC. Los principales resultados en EAEC, muestran un aumento en la expresión del gen que codifica la toxina Pet (pet) y una menor expresión del gen que codifica para Flagelina (fliC). Para STEC se observó una mayor expresión del regulador maestro Ler (gen ler) y en los genes que codifican la fimbria Lpf. Considerando que la fimbria Lpf participa en la respuesta inflamatoria inducida por STEC, se realizaron experimentos con la cepa mutante en la fimbria Lpf, observando la participación de este factor de virulencia en el aumento de secreción de IL-8 mediado por E. albertii. Posteriormente, se evaluó el uso de un modelo celular 3D organotípico de la mucosa intestinal para el estudio de la respuesta inflamatoria de las cepas ECD, encontrando que la infección por ECD produce un aumento en la secreción de IL-8, GRO, IP10, GM-CSF y TNF-α. La infección de este modelo con STEC, en presencia del sobrenadante de E. albertii, confirmó el aumento en la secreción de IL-8. Finalmente, se realizaron experimentos con un modelo in vivo de virulencia, la larva Galleria mellonella, observando que las larvas co-infectadas con la cepa ECD y E. albertii muestran una menor supervivencia que la condición control, lo que se correlaciona con una mayor virulencia de la cepa ECD en presencia de E. albertii. En conjunto nuestros resultados muestran que metabolitos secretados por una bacteria de la microbiota intestinal asociada a la infección por ECD, inducen un aumento en la expresión de factores de virulencia en cepas de EAEC y STEC, lo que conlleva a una mayor inducción de secreción de IL-8 sobre células en cultivo y una mayor virulencia de las cepas ECD en un modelo in vivo.

Diarrheagenic E. coli (DEC) are an important cause of diarrhea in children under five years old. The ability of DEC strains to colonize intestinal epithelium is related to the expression of virulence factors at the infection site. This process is highly regulated and relies on the interaction of pathogenic bacteria with environmental factors in the host. In the human gut, DEC strains interact with the host’s resident microbiota and its metabolites, which are responsible for producing an environment that prevents colonization by enteric pathogens in healthy conditions. However, previous studies have shown that some components of the gut microbiota can modulate the expression of virulence factors in DEC strains and promote the infectious process. Considering the above, in this thesis we hypothesize that “Bacteria from the gut microbiota of children with DEC-positive diarrhea induce a higher expression of virulence factors in EAEC and STEC strains and a higher inflammatory response induced by these DEC pathotypes on intestinal cells”. First, we determined the composition of the gut microbiota in children between

1 and 5 years old distributed in 3 groups: healthy children (Control group), children with DEC- positive diarrhea (DEC group) and children with diarrhea caused by an enteric virus (Viral

group). DNA from the stool samples of children in these groups was obtained and the 16S rRNA gene was amplified and sequenced by pyrosequencing. To determine the gut microbiota composition associated with each group, sequences were processed by bioinformatics and phylogenetic analyses. These analyses showed an increase in sequences belonging to phylum Proteobacteria and a decrease in those belonging to phylum Firmicutes in the DEC group compared to the Viral and Control groups. Also, samples were grouped in statistically different communities by a redundancy analysis. Finally, eight indicative species mainly associated with the DEC group were identified. Two indicative species that showed the highest significance, Escherichia albertii (E. albertii) and Citrobacter werkmanii (C. werkmanii), were selected to study their effect on the virulence of two DEC pathotypes: Shiga toxin-producing E. coli (STEC) and enteroaggregative E. coli (EAEC). When the induction of IL-8 secretion by the indicative species on epithelial cells was evaluated, it was found that E. albertii, unlike C. werkmanii, does not induce the secretion of IL-8 on intestinal cells. Based on this result, E. albertii was chosen for further experiments. We examined the effect of E. albertii and the supernatant obtained after overnight culture on (i) EAEC and STEC growth, (ii) DEC adherence to intestinal cells and (iii) IL-8 secretion induced by DEC strains on intestinal cells. A significant increase in IL-8 secretion was found when cells were infected with STEC or EAEC in the presence of E. albertii supernatant. Then, changes in the gene expression of DEC strains incubated with E. albertii supernatant were analyzed by RNA sequencing (RNA-seq), observing changes in the expression

of virulence factors for EAEC and STEC. For EAEC a higher expression in the Pet toxin- encoding gene (pet) and a lower expression in the Flagellin protein-encoding gene (fliC gene)

were found compared to the control condition. For STEC, we found a higher expression of the global virulence regulator Ler-encoding gene (ler) and the genes encoding Lpf fimbriae, with a decrease in the expression of the Shiga toxin-encoding gene (stx). Considering the participation of Lpf fimbriae in the STEC inflammatory response, using an Lpf mutant strain we confirmed the participation of this virulence factor in the induction of IL-8 secretion mediated by E. albertii supernatant. Additionally, an organotypic 3D model of intestinal mucosa was evaluated to study the inflammatory response induced by DEC strains. Using this model, we found an increase in IL-8, GRO, IP10, GM-CSF and TNF-α after infection with EAEC or STEC. Finally, in vivo experiments using the Galleria mellonella larvae model showed that larval co-infection with a DEC strain and E. albertii had a lower survival rate than the control condition, suggesting a higher virulence of STEC and EAEC strains in the presence of E. albertii. In summary, these results show that metabolites secreted by an indicative species of DEC-positive diarrhea induce a higher expression of virulence factors in EAEC and STEC strains, which produces a higher secretion of IL-8 on intestinal cells and a higher virulence in an in vivo model.