Impacto de la metilación de adenosinas en el destino citoplásmico del ARN genómico de VIH-1

Abstract

El virus de la inmunodeficiencia humana tipo-1 (VIH-1) es el principal agente causal del síndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Su genoma corresponde a una molécula de ARN de simple hebra con polaridad positiva (ARN genómico o ARNg), que se encuentra como un dímero en la partícula viral. Durante las etapas tardías del ciclo replicativo, el ARNg cumple dos funciones siendo utilizado como ARN mensajero para la síntesis de la proteína estructural Gag y Gag-Pol y como el genoma empaquetado en las nuevas partículas. Se ha determinado que el ARNg de VIH-1 existe como dos poblaciones que pueden cumplir una función a la vez. Análisis in vitro sugieren que cambios estructurales en la región 5 ́-no traducida (5 ́-UTR) del ARNg favorecen la traducción o el empaquetamiento, a pesar de que estudios estructurales realizados ex vivo e in virio no observan estas diferencias conformacionales ni un impacto de ellas en la traducción del ARNg. Adicionalmente, se reportó que la presencia de 1, 2 o 3 guanosinas en el extremo 5 ́ del ARNg impactan su estructura y, en consecuencia, su función como mensajero o genoma. Estudios recientes han demostrado que la presencia de modificaciones químicas del tipo N6-metiladenosina (m6A) en el ARNg favorecen la síntesis de proteínas virales. Análisis del laboratorio revelaron la presencia de m6A en la 5 ́-UTR del ARNg que se encuentra en la célula, pero no en la 5 ́-UTR del ARNg presente en las partículas liberadas, sugiriendo un rol de m6A en el empaquetamiento de este. En el presente trabajo de tesis evaluamos el impacto que tiene la m6A en el empaquetamiento del ARNg. De los resultados obtenidos observamos que un aumento en los niveles de m6A, mediado por el complejo metiltransferasa METTL3/14, induce un aumento de Gag intracelular, una disminución del empaquetamiento del ARNg, una disminución en la interacción Gag-ARNg y cambios estructurales en la 5 ́-UTR. La disminución en los niveles de m6A por el silenciamiento de METTL3 o la desmetilación mediada por FTO inducen un aumento del empaquetamiento del ARNg. Adicionalmente, observamos que Gag se asocia con FTO en el núcleo y disminuye los niveles de ARNg metilados. Finalmente, identificamos a las adenosinas 198 y 242 en la 5 ́-UTR como dos de los residuos que participarían en la regulación del empaquetamiento. Los resultados obtenidos en esta tesis sugieren que la ausencia de m6A en la 5 ́-UTR favorece el uso del ARNg como el genoma incorporado en las nuevas partículas virales, revelando un nuevo mecanismo molecular que regula el destino citoplásmico del ARN viral.

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) is the main etiological agent of the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). The viral genome consists of a single stranded positive sense RNA (genomic RNA or gRNA), which is found as a dimer within the viral particle. During the late stages of viral replication, the gRNA plays two major roles by acting as the messenger RNA for the synthesis of the structural protein Gag and Gag-Pol, and as the genome packaged into newly produced viral particles. It has been shown that gRNA it exists as two populations able to play only one function at a time. In vitro analysis suggested that structural switches within the 5 ́-untranslated region (5 ́-UTR) of the gRNA favors translation or packaging, despite the fact that structural analysis ex vivo and in virio do not support the existence of these conformational differences or an impact on gRNA translation. Additionally, it has been reported that the presence of 1, 2 or 3 guanosines at the 5 ́ of the gRNA impact its structure, and, in consequence, its function as a mRNA or genome. It was recently reported that the presence of the post-transcriptional modification N6-methyladenosine (m6A) on the HIV-1 gRNA promotes viral protein synthesis. Analysis of our laboratory revealed that the 5 ́-UTR of the gRNA contains m6A within the cell, but not in the viral particle, indicating that the absence of m6A within the 5 ́-UTR is probably necessary for the packaging of the gRNA. In the present thesis, we have evaluated the impact of m6A on the packaging of the HIV-1 gRNA. We observed that the increase on m6A levels, mediated by METTL3/14, induce an increase on intracellular Gag together with a strong decrease of the gRNA packaged into released viral particles, a decrease on Gag-gRNA interaction and structural changes in the 5 ́-UTR. The decrease of m6A level (mediated by METTL3 knockdown or FTO overexpression) induced an increase in the packaged gRNA. Interestingly, HIV-1 Gag associates with FTO in the nucleus to decrease the levels of methylated gRNA. Finally, we identified adenosines 198 and 242 within the 5 ́-UTR as two key residues responsible for the regulation of gRNA packaging mediated by m6A. Together, the results obtained in this thesis suggest that the presence of m6A on the 5 ́-UTR determines the use of the gRNA as the packaged genome revealing a novel molecular mechanism regulating the cytoplasmic fate of this viral RNA.