Clonamiento de los genes flgC y flgD de Piscirickettsia salmonis y estudio de su expresión in vivo

Abstract

El patógeno Piscirickettsia salmonis es el agente causal del síndrome rickettsial del salmón (SRS), enfermedad que afecta en gran medida a la industria salmonera nacional. Esta bacteria gram negativa ha sido descrita hasta ahora como intracelular obligada y no mótil, sin embargo existen evidencias recientes de nuestro laboratorio de la presencia de genes flagelares en su genoma. Debido a esto se consideró la posibilidad de que P. salmonis pudiera expresar un flagelo funcional en respuesta a estímulos que simulen sus estadíos extracelulares, como sería su inmersión en agua de mar. En la presente tesis se aislaron y secuenciaron los genes flagelares flgC y flgD a partir del ADN genómico de la bacteria. Ambos genes se expresaron en E. coli dando origen a las proteínas recombinantes FlgC y FlgD, con las cuales se desarrollaron anticuerpos monoclonales. Los estudios de expresión in vivo de los genes flgC y flgD, indicaron que éstos se transcriben como una sola unidad transcripcional, sin embargo no se pudo detectar la presencia de las respectivas proteínas mediante anticuerpos monoclonales. Igualmente, estudios de microscopía bajo diferentes condiciones de incubación tampoco detectaron la expresión de un flagelo. La falta de detección de las proteínas flagelares FlgC y FlgD o de un flagelo en P. salmonis puede deberse a que las condiciones de estimulación no fueron las adecuadas para que este se expresara. Alternativamente, es posible que a pesar que P. salmonis contiene la mayoría de los genes flagelares carece de alguno que es vital para la formación de la estructura. La función de estos genes en P. salmonis es mas bien incierta y se podría especular que tal vez forman parte de un sistema de secreción de tipo III, o que sólo son evidencia de algún resabio evolutivo o de algún evento de transferencia horizontal.

The pathogen Piscirickettsia salmonis is the causal agent of the salmon rickettsial syndrome (SRS), a disease that greatly affects the Chilean salmon industry. This bacterium has been characterized as obligate intracellular and non motile. However recent evidence obtained in our laboratory indicates the presence of flagellar genes as a part of its genome. Therefore, the possibility of the expression of a functional flagellar system in P. salmonis as a result of stimulation by conditions similar to the extracellular environment, such as sea water, has been considered. The flagellar genes flgC and flgD were isolated from P. salmonis genomic DNA and sequenced. Both genes were expressed as recombinant proteins in E. coli, and monoclonal antibodies produced. RT-PCR studies of flgC and flgD expression in vivo indicate that these genes are being transcribed together as a single transcriptional unit, but no flagellar proteins were detected using the monoclonal antibodies. Similarly, observations made by microscopy indicate that there is no visible flagellar structure in P. salmonis. The failure to detect these flagellar proteins and the absence of a flagellum may be due to the inappropriate conditions tested. On the other hand, in spite of having many flagellar genes, it is possible that P. salmonis lacks another one of these genes that may be fundamental for the assembly of the structure. Thus, the significance of the presence of these genes in P. salmonis genome remains undilucidated. They may be part of a type III secretion system, or perhaps they are evidence of an evolutionary remanent or the result of a horizontal gene transfer event.