Sobreexpresión de Transportadores de Nucleótidos Azúcar en dos Modelos Vegetales y su Rol en Síntesis de Pared Celular

Abstract

Todas las células necesitan de una matriz que las envuelva y proteja. En las células vegetales ésta recibe el nombre de pared celular, y además de estar involucrada en una serie de procesos fisiológicos es esencial para su desarrollo y crecimiento, variando su composición y estructura en el tiempo. La pared celular es una estructura compleja, donde microfibrillas de celulosa se unen por polímeros estructurados llamados hemicelulosas, todo embebido en una matriz gel de pectinas. Se puede clasificar en dos tipos: la pared celular primaria formada en las células en crecimiento, similar en todos los tipos celulares; y la pared celular secundaria formada en células que han detenido su crecimiento, de composición diferente a la anterior. La síntesis de los componentes celulósicos ocurre en la membrana plasmática, mientras que la de hemicelulosas y pectinas ocurre en el lumen del aparato de Golgi. En el mecanismo de síntesis de componentes de pared celular en el Golgi existe un problema topológico ya que las glicosiltransferasas encargadas del proceso, tienen su sitio catalítico orientado hacia el lumen del organelo, mientras los nucleótidos azúcar (NA) que utilizan como sustrato son sintetizados en el citoplasma. Por lo tanto se requeriría un mecanismo para la entrada de los NA al aparato de Golgi. Hoy en día se ha probado la existencia de transportadores de nucleótidos azúcares (TNAs) en el aparato de Golgi de variados organismos y se han encontrado secuencias homólogas a ellos en Arabidopsis thaliana. Un ejemplo de esto es la familia AtUTr donde se han identificado 7 genes que codifican para TNAs. Bajo estas evidencias se ha propuesto un modelo donde el NA ingresa al aparato de Golgi a través del transportador de nucleótidos azúcar. Luego, el azúcar es transferido a los polisacáridos en crecimiento por una glicosiltransferasa, liberando NDP; el cual es clivado por una NDPasa formando NMP y Pi. El NMP es devuelto al citoplasma por el transportador de nucleótidos azúcar en anti-transporte con el NA entrante, y el Pi es liberado al citoplasma por un transportador distinto. En este trabajo los genes de los TNAs AtUTr1, AtUTr2 y AtUTr7, que transportan selectivamente UDP-galactosa y/o UDP-glucosa, se sobreexpresaron en A. thaliana. Para ello los genes fueron clonados en un vector binario fusionados a un epítope Myc.His bajo el control de un promotor constitutivo. Primero, para corroborar su actividad, se expresaron los transportadores transitoriamente en hojas de tabaco, observando una acumulación de la proteína mediante western blot en fracciones celulares enriquecidas en aparato de Golgi y retículo endoplásmico. Además, encontramos que una mayor expresión de estos transportadores conlleva una mayor incorporación de los NA en fracciones subcelulares microsomales. Luego, mediante análisis RT-PCR de las plantas de A. thaliana transformadas con los genes AtUTr, se observó una alta expresión del transgen en cada uno de los casos, la cual variaba según las condiciones de crecimiento. Análisis cuantitativos de los componentes de la pared celular mediante espectrometría de masa mostraron un aumento de hasta 80% en el contenido de galactosa y manosa en las plantas transformadas respecto a las silvestres. Todos estos resultados apuntan a que los transportadores de nucleótidos azúcar estarían jugando un rol importante en la regulación de la síntesis de pared celular, pudiendo con ello a futuro modificar su composición selectivamente

All cells are surrounded by a protective matrix. In plant cells, this matrix is named the cell wall, and apart from being involved in many physiological processes, it is essential for the development and growth of the cell, with a variable composition and structure. The cell wall is a complex structure, with cellulose microfibrils joined by structured polymers termed hemicelluloses, embedded in a pectin gel matrix. It can be classified into two types: the primary cell wall produced in growing cells is similar in all cell types whereas the secondary cell wall produced in cells that have stopped growing, possesses a different composition to the primary cell wall. The synthesis of cellulosic compounds occurs at the plasma membrane, whilst the synthesis of hemicelluloses and pectins takes place in the lumen of the Golgi apparatus. A topological problem exists for the synthesis of cell wall components in the Golgi because the glycosyltransferases responsible for their synthesis possess catalytic sites facing the Golgi lumen, whereas the nucleotide sugar substrate (NS) are synthesized in the cytoplasm. Therefore, a mechanism is required to import NS into the Golgi lumen. Nucleotide sugar transporters (NSTs) have been shown to exist in the Golgi apparatus of a wide range of animals and homologous sequences have been found in Arabidopsis thaliana. One example in A. thaliana is the AtUTr family, composed of 7 members. Taken together, a model has been proposed whereby the NS substrate enters the Golgi apparatus via an NST. Subsequently, the sugar is transferred to the growing polysaccharide by a glycosyltransferase releasing NDP, which is cleaved by an NDPase forming NMP and Pi. The NMP is returned to the cytoplasm by the NST in antiport with the incoming NS, and the Pi is exported to the cytoplasm by a different transporter. In this work, the NSTs AtUTr1, AtUTr2 and AtUTr7 which selectively transport UDP galactose and/or UDP-glucose, were over-expressed in A. thaliana. For this purpose the genes were cloned in a binary vector with a Myc.His epitope under the control of a constitutive promoter. First, to verify their activity, the transporters where transiently expressed in tobacco leaves, with protein accumulation in Golgi and endoplasmic reticulum enriched fractions detected by western blot analysis. Furthermore, we found that a higher level of expression of these transporters resulted in a greater incorporation of the NS into microsomal fractions. Subsequently, using RT-PCR analysis of A. thaliana plants transformed with the AtUTr genes, a high level of expression of the transgenes was observed in each case, although levels varied depending on the growth conditions. Quantitative analysis of cell wall components by mass spectrometry showed an increase of up to 80% in the galactose and mannose content of transformed plants with respect to wild type controls. These results suggest that nucleotide sugar transporters play an important role in the regulation of cell wall synthesis, leading to the possibility of selectively modifying the composition of the matrix in the future