Caracterización y regulación hormonal de las alfa-amilasas de Araucaria araucana (MOL)KOCH.

Abstract

Las semillas de Araucaria araucana contienen almidón (61% de su peso seco) cuyo desdoblamiento y slntesis de sacarosa mantiene el crecimiento y desarrollo de la plántula hasta que ésta puede establecerse como planta autotrófica. La degradación del almidón durante este tiempo se correlaciona con la actividad amilolltica presente en el embrión y en el gametofito. Una de las enzimas que inicia la degradación del almidón en ambos tej idos es la a-amilasa. La actividad de esta enzima fluctúa durante las primeras 90 hrs de imbibición de la semilla. Existen múltiples formas enzimáticas de la a-amilasa con un patrón muy caracterlstico que cambia con el tiempo de germinación y desarrollo de la plántula. El objetivo de esta tesis fue probar las siguientes hipótesis: "En la semilla de A. araucana las isoenzimas de la a-amilasa son codif icadas por diferentes genes o grupos de genes estructurales. si es a s L, diferencias en el análisis de su estructura primaria reflejará esas diferencias genéticas". "La expresi6n de los genes que codifican para la a-amilasa en semillas y plántulas de ~ araucana podria ser mediada por la acción de giberelinas end6genas y por ácido abscisico. si este es el caso, la presencia o ausencia de estas hormonas produciria cambios en el patr6n isoenzimático de la a-amilasa que es característico de una etapa particular del desarrollo y podría explicar también las diferencias en niveles de actividad de la enzima entre el megagametofito (n) y la p1ántu1a (2n)". Para probar las hipótesis se caracterizó parcialmente la estructura de las isoenzimas presentes en semillas de Araucaria araucana. Para ésto, las isoenzimas de la semilla quiescente fueron purificadas por etapas sucesivas con tratamiento a 700C, precipitación con glicógeno y por cromatografia de afinidad, Sefarosa-cic1ohepta ami10sa. En ge1es de poliacri1amida-SDS se determinaron las masas moleculares. Estos fluctuaron entre 45,7 y 55,2 kDa. Los puntos isoeléctricos de estas isoformas fueron de: 6,0; 5,8; 5,6; 5,1; 5,0 Y 4,8. Geles bidimensiona1es permitieron correlacionar el punto isoeléctrico con la masa mo1ecular de algunas de las isoenzimas. Las isoformas con punto isoeléctrico de 5,8; 5,6; 5,1 Y 5,0 correspondieron a aquéllas de 53,5; 50,2; 47,0 Y 52,0 kDa respectivamente. Se descartó la posibilidad que las diferentes isoformas fueran producto de proteo1isis de una única forma original con el uso de los inhibidores de proteasas: fluoruro de fenil metil sulfonilo o N-tosil-L- fenilalanina clorometilcetona. Las isoenzimas de a-amilasa purificadas fueron fraccionadas' por cromatografía de intercambio iónico DEAE celulosa. Las dos isoformas mayores fueron separadas una de otra y del resto de las formas enzimáticas con un gradiente lineal salino de O a 0,6 M de NaCl bajo concentraciones levemente diferente de CaC12· La electrotransferencia de las isoenzimas a una membrana de difluoruro de polivinilideno previamente teñida con azul de Coomassie, permitió aislar preparativamente cada una de ellas y determinar la composición aminoac1dica de las isoenzimas de 53,5; 50,2 Y 47,0 kDa. La composición aminoac1dica reveló que estas isoenzimas fueron ricas en glicina, ácido aspárticojasparragina, alanina, serina, prolina y ácido glutámicojglutamina. La secuencia aminoac1dica terminal de las isoenzimas electrotransferidas a una membrana de inmobilon, fue determinada por degradación de Edman usando un secuenciador automático. Los derivados fenil tiohidant01neos de los respectivos aminoácidos fueron identificados por HPLC en fase inversa. Los resultados revelaron que la secuencia amino terminal de las isoenzimas eran idénticas entre ellas. La comparación de la composición aminoac1dica entre las isoenzimas de Araucaria araucana con las isoenzimas de alto y bajo pI de Hordeum vulgare y con las de Vigna radiata analizadas por la relación de Cornish-Bowden sugiere que no existe relación entre éstas y las de Hordeum vulgare y las de Vigna radiata. También la comparación de la secuencia amino terminal de las isoformas de ~ araucana con las de Oriza sativa y Hordeum vulgare reveló que eran distintas 'a las a-amilasas de Gram1neas. Sin embargo, los anticuerpos policlonales generados contra las a-amilasas de alto y bajo pI de cebada dieron inmunoreacción cruzada con las isoenz imas de a-ami1asa de ~ araucana existiendo aproximadamente treinta veces menor identidad de los anticuerpos por la proteina de Araucaria araucana que con las de cebada. Los mapas peptldicos para cada una de las isoformas de a-ami1asa de ~ araucana separadas en gel de pOliacrilamida-SDS se realizó por tratamiento de la proteina con bromuro de cianógeno. Los patrones peptidicos obtenidos mostraron que habia diferencias y similitudes genéticas entre ellas. El análisis de glicosi1ación de las formas de a-ami1asa de ~ araucana realizado por tinción fluorescente con ácido pery6dico-dansi1hidrazina, reveló que estas isoenzimas podrian ser glicoproteinas. Semillas embebidas durante 90 hrs con B-c1oroeti1 trimetilamonio (CCC) , inhibidor de la síntesis de giberelinas, afectó la expresión génica de tres isoenzimas de la a-ami1asa de la p1ántu1a y disminuyó la expresión de las otras isoformas presentes a este tiempo. Acido giberé1ico (GA» agregado al medio de incubación en semillas tratadas con CCC, permitió la recuperación de la actividad ami1ásica y la expresión de todas las formas de la enzima presente a esa edad de la p1ántula. En cambio, el tratamiento de las semillas con ácido abscísico (ABA) afectó a sólo una de ellas teniendo un efecto leve sobre las otras isoformas. Por consiguiente, GA) Y ABA controlan la expresión de los genes de la a-amilasa o grupos de genes que dan origen a éstas isoenzimas en la plántula. La actividad enzimática de la a-amilasa del gametof i to no se vio afectada por el inhibidor de la síntesis de giberelinas ni por el ácido absc1sico. Esto podr1a deberse a que la regulación de la expresión en e~ mega gametofito es diferente a aquella encontrada en la plántula. Las diferencias halladas en la composición aminoac1dica, en los análisis de los mapas peptldicos, en la afinidad por el calcio y la expresión diferencial de las isoenzimas por las hormonas sugieren que estas isoenzimas de la a-amilasa de semillas de ~ araucaria son codificadas por distintos genes o grupos de genes estructurales.

Araucaria araucana seeds contain starch (61% of dry weight) whose degradation and sucrose synthesis maintains growth and development of the seedling, until it can establish itself as an autotrophic plant. Starch degradation during this time is correlates with the amylolytic activity present in the embryo and gametophyte. One of the enzymes which starts starch degradation in both tissues is a-amylase, whose activity fluctuates during the first 90 hours of seed imbibition. There are multiple enzymatic forms of a-amylase in A.i. araucana, wi th a very characteristic pattern that changes with the germination and developmental stage of the seedling. The purpose of this thesis was to test the hypothesis: "In & araucana seeds the a-amylase isoenzimes are codified by different gene s or groups of structural genes. If this is so, then the differences in their primary structural analysis will reflect these genetic differences". "The express ion of the genes cOdifing for a-amilase in &.. araucana seed and seedlings could be mediated by the action of endogenous gibberellins and abscisic acid. If this is the case, the presence or absence of these hormones would produce changes in the a-amylase isoenzymatic pattern, which is characteristic of a specific developmental stage, and could also explain the differences in the enzymatic activity levels between megagametophyte and seedlings". To test the hypothesis, the structure of a-amylase isoenzymes of ~ araucana seeds was partially characterized. The quiescent seed isoenzymes were purified through successive steps which included: 700C treatment, precipitation with glycogen and affinity chromatography, cyclohepta-amylose-Sepharos~ 6B. The determination of molecular weights was done in polyacrylamide-SDS gels. These weights fluctuate between 45.7 and 55.2 kDa. Isoelectric points of these isoforms were: 6.0, 5.8, 5.6, 5.1, 5.0 and 4.8. Bidimensional electrophoresis allowed correlation of the isoelectric points with the molecular weight of some of the isoenzymes. Isoforms at isoelectric points 5.8, 5.6, 5.1 and 5.0 corresponded to molecular weights of 53.5, 50.2, 47.0 and 52.0 kDa. The possibility that different isoforms could be the product of proteolysis of a single original form was eliminated by the use of protease inhibitors. Purified a-amylase isoenzymes were separated by DEAE cellulose ionic exchange chromatography. The two main isoforms were separated from each other and the rest of the enzymatic forms by a lineal saline gradient of O to 0,6 M NaCl, and slightly different CaCl2 concentrations. The electrotransference of the isoenzymes to a polyvinylidene difluoride membrane previously dyed with Coomassie Blue, enabled the isolation and the determination of the aminoacid composition of three isoenzymes of 53.5, 50.2 and 47.0 kDA. Aminoacid composition revealed that these isoenzymes were rich in glycine, aspartic acid/asparagine, alanine, serine, proline and glutamic acid/glutamine. The terminal aminoacidic sequence of the isoenzymes electrotransferred to an inmobilon membrane was determined by Edman degradation, using an automatic sequencer. The phenylthiohydantoins derivatives of the corresponding aminoacids were identified by reverse phase HPLC. Results revealed that the terminal aminoacidic sequences of the isoenzymes were identical. Comparison of the aminoacids composition between the fu.. araucana isoenzymes with the high and low pI barley isoenzymes, and wi th those of Vigna radiata analyzed via the Cornish-Bowden relation, suggested that there was no relation between these and those of Hordeum vulgare and Vigna radiata. Also the comparison of the terminal aminoacidic sequence of the A. araucana isoforms with those of the Gramineae a-amylase revealed that they were different. However, polyclonal antibodies generated against the high and low pI bar ley a-amylase gave cross immunoreaction to the A. araucana a-amylase isoenzymes; there was approximately thirty times les s reaction of antibodies for the fu.. araucana proteins than for those of barley. peptide maps fu.. araucana a-amylase isoforms separated in polyacrylamide-SDS gels were obtained by treating the protein with cyanogen bromide. These peptide patterns suggest that there were genetic differences and similarities between them. Glycosilation analysis of the ~ araucana a-amylase forms was effected with fluorescent protein dye with periodic aciddanzylhydraz ine, revealing that these isoenzymes could be glycoproteins. In seeds irnbibed for 90 hours with B-chloroethyltrirnethyl ammonium (eee) which inhibits gibberellin synthesis, gene express ion of three a-amylase isoenzymes in the embryo was affected and the express ion of the other isoforms present at the time was diminished. When gibberellic acid was added to the incubation medium of seeds treated wi th eee the amyloli tic activity and the expression of all forms of the enzyme present at that age of the seedling were recovered. Treatment of the seeds with abscisic acid for 90 hours affected only one of the isoforms, and had a slight effect on the others. Therefore, GA3 and ABA control express ion of the a-amylase genes or groups of genes g i ving r ise to these isoenzymes in the embryo. The enzymatic activity of the gametophyte a-amylase was not affected by the gibberellin synthesis inhibitor, nor by abscisic acid. This could be due to the fact that the regulation of the express ion in the megagametophyte is different frorn that found in the seedling. oifferences found in aminoacidic cornposition, in peptide rnap analyses, in affinity for calcium and the differential expression of the isoenzyrnes by hormones, suggest that the a-arnylase isoenzymes in ~ araucana seeds could be codified by different gene s or groups of structural genes.