Participación de las comunicaciones intercelulares tipo Gap Junctions en la citotoxidad de linfocitos T CD8+ contra células de melanoma

Abstract

Las Gap Junctions (GJ) son canales intercelulares que permiten la comunicación entre células adyacentes, y participan en importantes procesos biológicos tales como el balance homeostático, proliferación, diferenciación y muerte celular. Están formadas por 2 estructuras llamadas conexones, y cada conexón está compuesto por 6 subunidades llamadas conexinas (Cx), siendo Cx43 la proteína más expresada en células del sistema inmune en mamíferos. La comunicación por contacto físico entre células del sistema inmune es primordial tanto en la activación de los linfocitos como en el reconocimiento de las células blanco. Publicaciones previas de nuestro laboratorio han demostrado que las GJ compuestas de Cx43 (GJ-Cx43) se polarizan en el sitio de interacción entre células dendríticas (DC) y linfocitos T (LT) durante la sinapsis inmunológica y que participan en la presentación cruzada de antígenos de melanoma por parte de DCs humanas favoreciendo la activación de L T CD8+ antígeno-específicos. Posteriormente, se estableció que la formación de GJ-Cx43 son importantes para la activación y citotoxicidad de las células Natural Killer (NK) contra células de melanoma. Basado en los antecedentes expuestos, y en la similitud funcional entre células NK y LT CD8+, en este trabajo proponemos que: las comunicaciones intercelulares tipo Gap Junctions formadas por Cx43 participan en la citotoxicidad de linfocitos T CDS+ contra células de melanoma. Para comprobar esta hipótesis, realizamos co-cultivos de linfocitos T CDS+ con células de melanoma, y determinamos en ellos la polarización de Cx43 hacia el sitio de interacción mediante microscopia, la formación de canales funcionales mediante ensayos de transferencia de Calceína, y estudiamos el efecto del bloqueo específico de los canales GJ-Cx43 en la citotoxicidad de los LT CD8-. uestros resultados indican que Cx43 se polariza hacia el sitio de contacto entre LT CD8- y células de melanoma formando placas de Cx43, las cuales forman GJ funcionales. Finalmente, demostramos que las GJ-Cx43 son importantes en la función efectora de los LT CD8+ contra células de melanoma, ya que la inhibición específica de estos canales durante la interacción de estas células, reduce significativamente la capacidad citotóxica de los LT CD8+. En resumen, nuestros resultados muestran que las comunicaciones intercelulares mediadas por Gap Junctions participan en los procesos citotóxicos de eliminación de células tumorales por parte de LT CD8+. Estos resultados podrían ser relevantes para el diseño de nuevas estrategias inmunoterapéuticas, permitiendo direccionar futuras investigaciones biomédicas que involucren el rol de las conexinas en la sinapsis inmunológica de la respuesta inmune antitumoral.

Gap Junctions intercellular communication (GJ) allow the communication between adjacent cells, and are involved in important biological process such as the homeostatic balance, proliferation, differentiation and cell death. GJ are composed by two structures called connexons, and each connexon is formed by 6 subunits called connexins (Cx), being Cx43 the most expressed in immune cells in mammals. The communication by physical contact between cells ofthe immune system is essential for processes that include the activation of lymphocytes and the recognition of the target cell. Previous reports from our laboratory have shown that GJ composed ofCx43 (GJ-Cx43) are polarized to the site of interaction between dendritic cells and T lymphocytes during the immunological synapse, where it participates in the cross-presentation of melanoma antigens by human DCs to specific CD8+ T cells. Subsequently, we established that the formation ofGJ-Cx43 is important for the activation and cytotoxicity of Natural Killer cells (NK) against melanoma cells. Based on this evidence, and based on the functional similarity between NK cells and CD8+ T cells, we propose that Gap Junctions intercellular communication formed by Cx43 participate in the cytotoxicity of CD8+ T cells against melanoma cells. To test this hypothesis, we performed co-cultures of CD8+ T cells with melanoma cells, and detennined the polarization of Cx43 to the contact site by microscopy, the formation offunctional channels by calcein transfer assays, and the effect ofspecific blockade ofthe charmeIs in the cytotoxicity of CD8+ T cells. Our results indicate that Cx43 polarize to the contact site between CD8+ T cells and melanoma cells forming plaques of Cx43, which form functional GJ. Finally, we demonstrate that GJ-Cx43 are important in the effector functions of CD8+ T cells against rnelanorna cells, because a specific inhibition of these channels during the intera tion of these cells significantly reduced the cytotoxic capacity of CD8+ T cells to kill a target cell. In summary, our results show that Gap Junctions intercellular communication participate in the cytotoxic processes of tumor cell elimination by CD8+ T cells. These results could be relevant for the design of novel immunotherapeutic strategies, highlighting the relevance ofbiomedical research related to this field in the immunological synapse ofthe antitumoral immune response.