Megalina: Modelo de estudios de nuevos aspectos del trafico intracelular constitutivo en células polarizadas

Abstract

Megalina es un receptor endocítico de la superficie celular que pertenece a la familia de receptores LDL-R. Su expresión está restringida a células de epitelio de absorción, como el túbulo proximal del riñón, pulmón y tiroides. En estos tejidos, megalina se localiza en la cara apical donde interacciona con diversos ligandos que no sólo comprenden lipoproteínas, sino que también, complejos de vitaminas y hormonas, entre otros. El hecho que ratones knock-out para megalina muestren defectos en el desarrollo neuronal, sugiere que la función del receptor es fundamental durante el desarrollo. Por otro lado, una de las características más relevantes de megalina, en el adulto, es su alta actividad endocítica. En tejidos como el túbulo proximal del riñón, megalina es el principal receptor encargado de la recaptación de sustancias vitales filtrados por el glomérulo, como complejos de vitamina D. Adicionalmente, en algunos tejidos este receptor no transporta sus ligandos hacia la vía degradativa sino que promueve la transcitosis de algunos de ellos, como la tiroglobulina y RBP. La regulación del tráfico celular de este receptor aún no ha sido explorada completamente y constituye el objetivo central de esta tesis. Se postuló que en el dominio citosólico de megalina existirían motivos que podrían regular el tráfico celular del receptor. Entre ellos se destacan (a) un motivo rico en prolinas, ATPPPSP, que constituye un motivo de unión a dominios SH3, (b) un motivo SEV que constituye un sitio interacción con vii dominios POZ, (e) cuatro potenciales motivos de endocitosis mediada por c1atrina (LL, NPXY, NxxY y YXX~) y (d) motivos de consenso de fosforilación por PKC, PKA y CK-II. Este trabajo se centró en la caracterización detallada de los motivos presentes en el dominio citosólico de megalina involucrados con la regulación del tráfico de este receptor, tanto a nivel de su endocitosis como localización polarizada. En relación con la localización polarizada de megalina, este receptor resultó ser un excelente modelo de estudio puesto que se encontró que en el dominio citoplasmático existía información para su destinación a la superficie apical de células epiteliales. Este hallazgo representa el primer ejemplo de una proteína con un dominio de transmembrana que contiene información apical en este dominio celular. En este trabajo también se revelaron dos propiedades de megalina no descritas previamente. La primera, es la asociación del receptor con microdominios lipídicos ricos en colesterol y glicoesfingolípidos, que conforman las denominados "balsas lipídicas", y la segunda es la interacción con proteínas del citoesqueleto. Se caracterizaron ambos tipos de interacciones y se encontró que los motivos de unión a dominios SH3 y POZ, presentes en el dominio citosólico del receptor participan en la asociación con proteínas del citoesqueleto de actina. A su vez, la asociación de megalina a balsas lipídicas está regulada por la integridad del citoesqueleto de actina y no es un requisito para la destinación apical del receptor. viii Uno de los objetivos principales de este trabajo consistió en estudiar los motivos involucrados en la endocitosis de megalina. Primero, se mostró que la internalización del receptor es un proceso mediado por clatrina y que está regulada, en parte, por el primer motivo NPxY del dominio citosólico. Por otro lado, se encontró que el motivo de unión a dominios SH3 modula la velocidad inicial de internalización del receptor y que el motivo de unión a dominios PDZ es requerido para mediar la degradación eficiente de ligandos. Evidencias anteriores del laboratorio mostraban que el dominio citosólico de megalina era fuertemente fosforilado in vivo. Sin embargo, la naturaleza de esta fosforilación y su potencial función no habían sido descritas. Un hallazgo importante, obtenido en esta tesis, fue la identificación del motivo principal de fosforilación del dominio citosólico, el cual corresponde a un residuo de serina que se encuentra dentro de un motivo del tipo PPPSP. Los datos muestran que la fosforilación del motivo PPPSP podría ser mediada por Caseína quinasa Il (CK-Il), y que regularía negativamente la internalización de megalina. De los estudios del dominio citoplasmático de megalina realizados en esta tesis se obtuvo información novedosa y relevante con respecto a la función y tráfico de megalina, contribuyendo no sólo al campo de estudio del receptor, sino a aspectos más amplios del tráfico de proteínas en células polarizadas y no polarizadas.

Megalin is a cell surface endocytic receptor that belongs to the LDL-R family. Its cellular expression is restricted to absorptive epithelia such as the kidney proximal tubule, lung and the thyroid gland. In these tissues, megalin is localized along the apical surface, where it interacts with diverse ligands that not only comprise lipoproteins, but also include vitamin complexes, hormones, among others. The fact that knock-out mice show important abnormalities in neuronal development suggests that the function of this receptor is of fundamental importance during development. On the other hand, one of the most relevant characteristics of megalin, in adults, is its high endocytic activity. In tissues, such as the proximal tubule, megalin is considered the main receptor responsible for the retrieval of vital elements from the glomerular filtrate, such as vitamin D complexes. Additionally, in other tissues this receptor does not transport its ligands to the degradative pathway and instead promotes the transcytosis of certain ligands such as thyroglobulin and RBP. Regulation of the cellular trafficking of this receptor has not been fully explored and constitutes the main objective of this thesis. We postulate that the megalin cytoplasmic doma in contains motifs that regulate cellular trafficking of the receptor. Among the motifs present within this domain, are (a) a proline-rich region, ATPPPSP, that is an SH3 binding motif, and (b) a carboxyl terminal SEV motif that potentially binds PDZ domains, (c) four x putative clathrin-mediated endocytic signals (LL, NPXY, NxxY y YXX~) and (d) several potential phosphorylation sites for PKC, PKA y CK-II. In this study, motifs within the megalin cytoplasmic domain were characterized in detail in terms of their function in endocytosis and the polarized localization of the receptor. Regarding the polarized localization of megalin; this receptor was shown to be an excellent model beca use we found information for its apical localization in the cytoplasmic domain of megalin. This finding represents the first example of a protein with a single transmembrane domain that contains sorting information in this cellular domain. In addition, two new properties of megalin have been revealed. The first one is the association of the receptor with lipid microdomains enriched in cholesterol and glycosphingolipids, termed lipid rafts, and the second is the interaction of the receptor with actin associated proteins. Both of these interactions were characterized and the results show that the SH3 and PDZ interacting motifs within the cytoplasmic tail of megalin were involved in the association with the actin cytoskeleton. Additionally, the association between megalin and lipid rafts is regulated by the integrity of the actin cytoskeleton and is not required for the apical localization of the receptor. An important aim of this study was to define the endocytosis signal(s) present within the cytoplasmic tail of megalin. First, we showed that the internalization of the receptor is a clathrin-mediated process that is partially xi regulated by the first NPxY motif present within the cytosolic tail. In addition, the data indicate that the SH3 binding motif regulates the initial internalization rate of the receptor and the PDZ binding motif is required for efficient ligand degradation. Preliminary evidence from our laboratory has shown that the cytosolic doma in of megalin is strongly phosphorylated in vivo. However, the nature of this phosphorylation and its potential function were unclear. An important discovery achieved in this thesis was the identification of the principal motif involved in the phosphorylation of the cytoplasmic tail of megalin which corresponds to a serine residue within the proline region PPPSP. The data also suggest that phosphorylation of the PPPSP motif could be mediated by Casein Kinase II (CK-Il) and that it negatively regulates the internalization of megalin. Analysis of the cytoplasmic motifs within the megalin cytosolic domain provided novel and relevant information concerning megalin's function and trafficking and has also contributed to the knowledge of broader aspects regarding receptor trafficking in polarized and non-polarized cells.