Análisis de la expresión del gen hsp70 mediante RT-PCR semi-cuantitativo, en plantas de Aloe barbadensis Miller, sometidas a estrés térmico e hídrico

Abstract

Aloe barbadensis Miller, cuyo nombre común es Aloe vera, es una planta perteneciente a la familia Asphodelaceae y naturalmente adaptada a zonas áridas y de gran oscilación térmica. El gel de Aloe es de gran importancia económica debido a las propiedades alimenticias, farmacéuticas y cosmetológicas que se le atribuyen. Por esta razón, su cultivo en el norte de Chile ha tenido una gran expansión, pese a no existir un manejo agronómico adecuado. El siguiente trabajo pretende aportar al conocimiento de esta planta frente a las condiciones de estrés hídrico y de alta temperatura, en cuanto a la expresión de proteínas de estrés térmico, como HSP70, una chaperona que repliega las proteínas desnaturalizadas. Se diseñaron partidores desde secuencias de hsp70 homólogas en otras plantas, para amplificar por PCR. La clonación y secuenciación del fragmento obtenido, junto con un análisis bioinformático de su secuencia, confirmó que los partidores amplifican el gen hsp70 de Aloe vera. Con el uso de estos partidores se analizó la expresión del gen hsp70 mediante RT-PCR semi-cuantitativo. Se analizó la expresión de este gen en estrés térmico, incubando a 25°, 35°, 40° y 45°C, y se observó un aumento en la expresión del 47% a 40°C y 45°C. En estrés hídrico, se observó un aumento en la expresión en cada tratamiento T1, T2, T3 у T4 (1600, 1200, 800 y 400 mL/planta/15 días), correlacionado con la intensidad del estrés. Estos resultados sugieren que en Aloe vera el gen hsp70 aumentaría sus niveles de mRNA, y probablemente también de la proteína, a altas temperaturas y en déficit hídrico, replegando las proteínas dañadas en estas condiciones. Este mecanismo sería parte de la respuesta que se activa en Aloe vera frente al estrés hídrico y térmico. Además, se diseñaron partidores para estudiar la expresión los genes de estrés térmico, hsp100 y ubiquitina, obteniendo por PCR bandas del tamaño esperado, lo cual permitirá realizar similares estudios de expresión. Estos resultados comprueban que Aloe vera es una planta con aumentada tolerancia al estrés térmico e hídrico, por lo cual puede considerarse como una planta modelo para estudios de mejoramiento vegetal, para producir plantas para cultivo con mayor rendimiento en condiciones de estrés ambiental.

Aloe barbadensis Miller, also known as Aloe vera, is a CAM plant of the Asphodelaceae family, and is well-adapted to arid regions with extreme thermal oscillations. The gel of Aloe is economically important due to their cosmetic, pharmaceutical and alimentary properties. For this reason, there has been an expansion in the cultivation of this species, even though appropriate agricultural practices are lacking. The following work intends to contribute to the knowledge of how Aloe vera responds to water and heat stress, focusing on the expression of heat shock proteins, such as HSP70, a chaperone which has been extensively studied due to its ability to repair denatured proteins. PCR primers were designed against conserved regions of orthologous hsp70 gene sequences from plants. Cloning and sequencing of the amplified fragment, and analysis of the resulting sequence, showed that these primers did indeed amplify a partial hsp70 gene from Aloe vera. Expression of hsp70 was quantified by semi-quantitative RT-PCR at high temperatures and under drought conditions. Expression of hsp70 increased by 47% at 40°C and 45°C, compared to the expression levels at 25°C. Under restrictive water conditions, the relative expression of this gene increased gradually from a normal water irrigation regime T1 to T2, T3 and T4 (1600 to 1200, 800 and 400 mL/plant/15 days, respectively), according to the intensity of stress. These results suggest that in Aloe vera subjected to high temperature or water deficit conditions, the expression of hsp70 increases, as a means to refold proteins damaged under these stresses. This mechanism would form a part of the response that is activated in Aloe barbadensis Miller under heat and drought stress. Moreover, in order to study the expression of other heat shock genes, primers were designed to amplify hsp100 and ubiquitin, and the corresponding fragments amplified from Aloe vera were of the expected size. These primers are thus a tool which will allow similar expression studies of these genes to be performed. This results verify that Aloe vera is a plant with high tolerance to heat and drought stress, so it can be considered as a model plant for vegetal improvement in order to obtain crops with higher yield in field with ambiental stress.