Descubrimiento de polimorfismos de un sólo nucleótido (SNPs) para Salmo salar en genes asociados a vías de señalización de sistema inmune

Abstract

In recent years, the production of Salmo salar or Atlantic Salmon in Chile has undergone a considerable expansion. Due to this, the implementation of research programs aimed at the innovation for developing competitive advantages has been regarded as an important role in Chilean governmental policies. Thus, the following work focuses on the discovery of novel single nucleotide polymorphisms in immune system signalization associated genes, for the generation of new genetic markers for the development of superior breeding lines which may show advantage in terms of disease resistance to local producers. Numerous techniques have been established for the genotyping of single nucleotide polymorphisms or SNPs. High resolution melting curve analysis (HRMA) has proven to be a precise, low-cost and medium throughput technology, which fits all our requirements. The method was tested on a previously known polymorphism (SNP356), which was previously genotyped in our laboratory by microarray analysis. Results demonstrated full concordance, proving HRM reliability. HRM was used to genotype 6 other polymorphisms from which we had no previous information. These polymorphisms were discovered by in silico analysis of EST sequences extracted from cGrasp database. Three out of six SNPs were polymorphic, giving a 50% success rate. Sequences containing the polymorphisms were aligned using the blast algorithm against the NCBI database. The highest scoring genes were used to individualize the three SNPs discovered. Two of them, were in the 3'UTR region, and the other was in the coding sequence (CDS) of the mRNA. As point mutations in the untranslated region do not tend to generate significant changes in protein structure or function, we suppose these as silent mutations. Nonetheless, as these genes have proven to be polymorphic, they could be very valuable mRNA associated molecular markers. On the other hand, TAP1 mutation was found to be in the CDS region, delivering a non-synonymous mutation from a glycine to a serine. One possibility is that these mutations could lead to the generation of susceptible, tolerant of resistant phenotypes. Further studies are needed to assess the presence of these newly discovered polymorphisms in infected salmon populations, as they could generate novel genetic lines with resistant infectious disease phenotypes.

La salmonicultura durante la década del 90, ha tenido un auge en exportaciones y producción total. Es por ello que se ha fijado como área prioritaria en investigación científica, aquellos proyectos que fomenten aumentos productivos de Salmo salar. En este contexto los marcadores moleculares, microsatélites o polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), han sido descritos como esenciales para la generación de nuevas líneas genéticas. Es por ello que mediante la identificación, validación, genotipificación y anotación de polimorfismos tipo SNPs, en genes asociados a vías de señalización en el sistema inmune en Salmo salar, se pretende dar un paso hacia la identificación de marcadores moleculares que ayuden a descubrir y reproducir líneas de selección que otorguen ventajas competitivas al producto nacional. Numerosas técnicas de genotipado de polimorfismos simples han sido desarrolladas. Para este trabajo y basado en la extensión del análisis, se optó por una técnica económica, precisa y de rendimiento medio llamada “denaturación de curvas en alta resolución". Esta se basa en la detección de los polimorfismos mediante la disminución de fluorescencia de un agente intercalante de ADN en el proceso de disociación de la doble hebra, siendo la señal fluorescente del fluoróforo más potente cuando se encuentra unida a la doble hebra de ADN. Los ensayos de genotipado por esta técnica se realizaron en muestras de 4 poblaciones comerciales y 1 naturalizada. Estas poblaciones permitieron encontrar polimorfismos de más de un 7% de frecuencia. Se escogieron los genes a analizar examinando trabajos en los que identificaran cambios de expresión de mRNAs bajo infecciones. Es así como se identificaron 8 genes putativos en los cuales buscar polimorfismos: Tiorredoxina, TAP1, ТAP2, B2-Microglobulina, PKR, IRF-1, C-typе Lectin y Mx1. De un total de 6 SNPs decubiertos in silico, 3 fueron polimórficos. Esto no incluye un polimorfismo usado para estandarizar y optimizar la técnica (SNP356), cuyo genotipo para las muestras ya era conocido. Nuestros resultaron finalmente demostraron un 50% de éxito entre SNPs descubiertos in silico y su validación. Por otro lado, de los 4 polimorfismos analizados, solo el SNP356 no tuvo puntajes significativos al hacer un blast de las secuencias obtenidas in silico contra la base de datos de NCBI. En tanto, para los SNPs TAP1, Tiorredoxina y 2ẞ-Microglobulina hubo puntajes significativos, encontrándose secuencias responsables de su transcripción. Para los polimorfismos ligados a estos tres genes, se vio que dos están en regiones 3'UTR, mientras que para TAP1, su mutación se encuentra en la región funcional de la proteína, conllevando un cambio desde glicina a serina, cambio que trae modificaciones a la proteína generada. Los polimorfismos obtenidos podrían ser analizados en poblaciones desafiadas a diferentes patógenos, con el objeto de ver si se corresponden con algún grado de resistencia, tolerancia o susceptibilidad a enfermedades infecciosas. De esta manera se podrían generar líneas de selección que aumenten la competitividad del salmón chileno.