Desarrollo de herramientas para el estudio del papel de GONST4, un transportador de nucleótidos-azúcar, de Arabidopsis thaliana

Abstract

En plantas, la pared celular es un compartimiento dinámico con importantes funciones Fisiológicas. Está compuesta de polisacáridos, glicoproteínas y compuestos fenólicos. En el lumen del aparato de Golgi se sintetizan hemicelulosas y pectinas, polisacáridos No-celulósicos y se adicionan azucares a las proteínas de secreción. Ambos procesos son Catalizados por glicosilhansferasas, enzimas que poseen su sitio catalítico en el lumen Del Golgi y que requieren, como sustrato de nucleótidos-azúcar sintetizados en la fase soluble del citoplasma. Por esto es indispensable la entrada de nucleótidos-azúcar al Lumen del organelo. Esta importación es realizada por transportadores de nucleótidos-azúcar (TNAs) específicos en plantas y en otros organismos. En este Seminario de Titulo se desarrollaron dos herramientas para estudiar GONST4, un TNA putativo de Arabidopsis thalíana. GONST4 posee características moleculares de TNAs y es ortólogo a transportadores de GDP-fucosa ya caracterizados. Por lo tanto, y con estos antecedentes bioinformáticos, creemos que este TNA es el mejor candidato para trarsportax GDP-fucosa, un sustrato requerido para la modificación de glicoconjugados específicos. Primero, se diseñó un vector para sobre-expresar GONST4 de manera transitoria en Nicotiana tabacum y así determinar la especificidad de sustmto de este transportador. Además, esta misma construcción nos permitirá sobre-expresar GONST4 en forma permanente en Arabidopsis. Segundo, en bases de datos públicas se identificaron tres líneas de mutantes de gonst4 insercionales e independientes. Las plantas con mayor y menor expresión de este TNA servirán como herramientas poderosas para comenzar a dilucidar la función in planta de GONST4.

In plants, the cell wall is a dyramic compartment that plays important physiological roles. It is composed of polysaccharides, glycoproteins and phenolic compounds. Noncellulosic polysaccharides, such as hemicelluloses and pectins are synthesised in the lumen of the Golgi apparatus and secreted proteins are also glycosylated in this organelle. Both processes are catalysed by enzymes called glycosyltransferases whose active sites face the Golgi lumen and which require cy.tosolically-synthesised nucleotide-sugars as substrates. For this reason, nucleotide-sugar uptake into the Golgi lumen is essential. This role is achieved in plants and other organisms by specific nucleotide-sugar transporters (NSTs). In tlris work, two tools for the study of GONST4, a putative NST of Arabidopsis thaliana were developed. GONST4 possesses the molecula¡ characteristics of an NST and is an orthologue of well-characterised GDP-fucose transporters. Therefore, based on bioinformatic analyses, we believe that GONST4 is the most likely candidate for the transport of GDP-fucose, a substrate required for the modification of specific glycoconjugates. Firstly, a vector for transiently over-expressing GONST4 in tobacco was designed in order to determine the substrate specificity of this transporter. The same construct will also be used to stably over-express GONST4 in Arabidopsis. Secondly, three independerú gonst4 inserlion lines were identifred in public databases. The plants with higher and lower expression will be powerful tools for determining the roles of GONST4 in planta.