Implementación de una estrategia molecular para incorporar genes en el genoma de S. cerevisiae

Abstract

La levadura Saccharomyces cerevisiae, es una henamienta indispensable de la ¡ngeniería genética. La gran mayoría de las estrategias de manipulación gén¡ca en esta especie, son de carácter transiente; pero en procesos industr¡ales, es necesaria la integración en el genoma de los genes de interés, para lo cual se utilizan vectores ¡ntegrat¡vos. En estos vectores, es indispensable la incorporac¡ón del gen y los elementos necesarios para una correcta expresión de los mismos. La estabil¡dad de los vectores integrat¡vos es independiente de la presión de selección, lo que posibil¡ta su uso en procesos de gran escala. En el presente trabajo planteamos desanollar una estrategia molecular para integrar y expresar de manera estable genes en el genoma de S. cereyislae. Se generaron vectores de expresión pRs306E y pRs316E provenientes del vector ¡ntegrat¡vo en el genoma pRs306 y centromérico pRs316. Para probar su funcionalidad, se sub-clonó en ellos el gen Athmal de A. thaliana el cual codif¡ca una ATP-asa de tipo P, capaz de otorgarle a la levadura la capacidad de acumular una mayor concentrac¡ón de cobre que su línea parental y tolerancia a cationes metálicos. Al realizar los ensayos de tolerancia a catlones metálicos para probar la funcionalidad de los vectores, no se observó crecimiento de colon¡as en ninguno de los med¡os suplementados. Esto puede deberse a la presencia de mutaciones encontradas en la secuencia util¡zada. La funcionalidad de los vectores generado deberá analizarse en el futuro.

The yeast Saccharomyces cerev¡siae:s an indispensable tool of genet¡c engineering. The vast majorities of gene manipulation strateg¡es in th¡s specie are transient, but in ¡ndustrial processes is necessary to ¡ntegrate the genes of ¡nterest into the microorgan¡sm genome for what integrat¡ve vectors are used. ln these vectors, the gene must be incorporated with the necessary elements for gene expression. The stability of integrative vectors is independent of selection pressure, allowing ¡ts use in large-scale processes. ln this work we propose to develop a molecular strategy for integrat¡ng and stably express genes in S. cereylslae genome. Expression vectors pRs306E and pRs316E were generated from the genome integrative vector pRs306 and the centromer¡c vector pRs316, To test their funct¡onality, we sub-cloned into them the gene Athmal from A. thal¡ana which encodes a Ptype ATPase, that confer the ability to yeast to accumulate a h¡gher concentration of copper than the parental line and tolerance to metal cations. When performing tests of tolerance to metall¡c cat¡ons, to test vectors functionality, there was no growth of colon¡es in media supplemented. This may be due to the presence of mutations in the cloned sequence. The functionality of the vectors generated should be analyzed in the future.