Importancia de la serina-84 y el motivo glicina-83 serina-84 de la microcina E492 en la modificación post-traduccional y en la actividad antibacteriana

Abstract

Las bacteriocinas son antibióticos de naturaleza peptídica producidas por un amplio espectro de bacterias Gram positivas y negativas. La microcina E492 es un péptido antimicrobiano de 84 aminoácidos producido por Klebsiella pneumoniae RYC492 activo contra especies de la familia Enterobacteriaceae. Su mecanismo de acción es la formación de poros en la membrana interna de la célula blanco. Mediante un proceso de modificación post-traduccional una molécula del tipo salmoquelina se une covalentemente a la Ser-84 del C-terminal, lo cual sería necesario para el reconocimiento por los receptores FepA, Fiu y Cir de la célula blanco. Cepas mutantes en los genes que codifican para las enzimas a cargo del proceso de modificación post traduccional de la microcina E492 producen microcina inactiva y no modificada. Alineamientos múltiples entre la microcina E492 y otras microcinas de la misma familia han mostrado que hay una gran identidad a nivel del C-terminal, conservándose en un 100% la Ser-84 y uno de los dos mot¡vos Gly-Ser en las posiciones 83-84. En esta Memoria se construyó una mutante de la microcina E492 en la que se reemplazó la Ser-84 por Thr, y otra con una remoción en el último motivo Gly-Ser. Estas mutantes presentaron una menor actividad bactericida comparadas con la microcina E492 silvestre. Por otra parte, la coexpresión de las microcinas mutantes con la silvestre no afectó la actividad global. EI análisis mediante espectrometría de masas de muestras purificadas de ambas mutantes revela la presencia de formas de mayor peso a la forma no modificada, que corresponderían a las especies modificadas post-traduccionalmente con moléculas del tipo salmoquelina.

Bacteriocins are peptidic antibiotics produced by a wide spectrum of Gram positive and negative bacteria. Microcin E492 is an 84 amino acid antimicrobial peptide produced by Klebsiella pneumoniae RYC492 active against species of the Enterobacteriaceae family. Its mechanism of action is the formation of pores in the inner membrane of the target cell. By means of a post-translational modification process, a salmokeline-type molecule covalently binds to Ser-84 at the C-terminus, which would be necessary for recognition by the target cell's FepA, Fiu and Cir receptors. Mutant strains in the genes that code for the enzymes in charge of the post-translational modification process of microcin E492 produce inactive and unmodified microcin. Multiple alignments between the E492 microkine and other microkines of the same family have shown that there is a great identity at the C-terminal level, conserving 100% of the Ser-84 and one of the two Gly-Ser motifs in the positions 83-84. In this Report, a mutant of the E492 microkine was constructed in which Ser-84 was replaced by Thr, and another with a removal in the last Gly-Ser motif. These mutants showed a lower bactericidal activity compared to wild type E492 microcin. On the other hand, the co-expression of the mutant microkines with the wild type did not affect the global activity. The analysis by means of mass spectrometry of purified samples of both mutants reveals the presence of forms of greater weight than the unmodified form, which would correspond to the post-translationally modified species with salmoqueline-type molecules