Metabolismo del triptófano en células dendríticas maduradas con cortos estímulos con lipopolisacárido

Abstract

Las células dendríticas (DCs) constituyen un grupo heterogéneo de células presentadoras de antígenos profesionales que juegan un papel fundamental en la respuesta inmune innata y adquirida. Éstas tienen el potencial de promover tanto la iumunidad como la tolerarcia in vivo. Se ha demostrado que el metabolismo del triptófano, específicamente la habilidad de degradar triptófano a quimrenin4 podría determinar el fenotipo inmunológico de estas células. Recientemente en nuestro laboratorio se han obtenido DCs murinas que poseen ciertas características tolerogénicas, como 1o son una alta secreción de citoqünas IL-10 y TGF-P, aI ser maduradas con lipopolisacrírido (LPS) por 4 horas (4hLPS,DCs). Es más, estas células al ser inyectadas en ratones artríticos, fueron capaces de modular negativamente la enfermedad. Debido a estos antecedentes esta tesis se enfocó a determinar si el metabolismo del triptófano esta involucrado o no en la habilidad supresora de las 4hLPS/DCs. En este trabajo se estudió e1 rol del metabolismo del triptófano en la tolerancia inducida invito por 4hLPS/DCs. Para analizar el ro1 del metabolismo del triptófano se estudió la expresión del gen Indo, que transcribe la enzima Indoleamina 2,3 dioxigenasa (IDO), enzima que genera la primera reacción y limitante de la vía de las quinureninas, mediante transcripción reversa acoplada a reacción en cadena de 1a polimerasa (RT-PCR). También se observó la cantidad de proteína de la enzima (IDO) mediante westem blot. Por ultimo, se generó un método mediante cromatograffa líquida de alta eficiencia, por el cual pudimos determinar la concentración de quinurenin4 metabolito del metabolismo del triptófano, a partir de meüo de cultivo de estas células, y así determinar la producción de quinurenina, o actividad de la enzima IDO, en estas células. Aquí demostramos que aunque el gen Indo es sobreexpresado en 4hLPS/DCs, esta sobreexpresión no se corelaciona ni con la cantidad de proteína ni con 1a actividad de ésta, ya que la cantidad de proteína y la producción de quinurenina no fue significativamente diferente en estas células, comparadas con DCs inmaduras, sin estimular con LPS (OhIPS,{DCs), o completamente maduras, estimuladas por 24 horas con LPS (24hLPS,DCs). Pudimos demostrar que DCs derivadas de médula ósea son capaces de secretar quinurenin4 refutando literatura sobre este tema, aunque los niveles detectados (0,3-0,5pM) son muy bajos para ser considerados inmunológicamente relevantes. Se determinó que las células secretoras de quinurenina son en efecto las DCs, ya que no se detectó quinurenina en medios de cultivo de DCs no puriñcadas, ni en medios de células CD1lc-, só1o se detectó en cultivos de células seleccionadas CDl lc*. En este estudio se estableció que el efecto inmunorregulador ejercido por 4hLPS,/DCs, no estaría dado por el metabolismo de1 triptófano, y que el mecanismo de su inmunosupresión debe ser dilucidado en trabajo futuro, fuera del contexto de esta tesis.

Dendritic cells @Cs) constitute a heterogenic group ofprofessional antigen presenting cells (APCs) that play a key role in the immune rcsponse, both innate and adaptive. These cells have the potential to promote both immunity and tolerance in vivo.lf has been proven that tryptophan metabolism, specifrcally the ability to transform trlptophan to §nurenine, can determine the immune pheno§pe of these cells. Recently in our laboratory we have obtained murine DCs with tolerogenic characteristics, like high secretion of the cytokines IL-10 and TGF-p, by matur¡ng these cells w¡th l¡popolysaccharide (LPS) for 4 hours (4hLPS,DCs). Moreover, these ce1ls when injected in arthritic mice, were capable of negatively modulating the disease. With this background this work focused on establishing iftryptophan metabolism is involved on üe suppressive propefies ofthe 4hLPS/DCs. In this work we studied the role of tryptophan metabolism in the tolerance irdtrced in-vivo by the 4hLPS/DCs. For this we studied the expression of the gene Indo, gene that transcribes the enzyme Indoleamine 2,3 dioxygenase (IDO) that generates the first and limiting reaction of the kynurenine pathway, by reverse transcription attached to the polymerase chain reaction (RT-PCR). We also observed the amount of protein IDO by westem b1ot. Finally we generated a mettrod of high performance liquid cbromatography that allowed us to determine the amount of kynurenine, metabolite of the tryptophan metabolism, from the culture medium of DCs, permitting us to determine the production of kynurenine and thus, activity of IDO in these cells. Here we demonstrated that although the gene Indo is overexpressed in 4hLPS/DCs, this overexpression doesn't correlate with the amount of protein nor with the activity of the enzyme, because the amount of protein and the production of kynurenine were not significantly different in these cells compared with the unstimulated DCs (0h,/LPSIDCs), or the cells stimulated for 24 hours with LPS (24hlLPS/DCs). We were able to determine that the DCs derived from bone malrow are capable of producing and secreting klnurenine, contradicting literature about this subject, although the levels detected (0,3-0,5pM) are too low to be considered immunologically relevant. We establish that the cells that sec¡ete kynurenine were in fact DCs, because no kynurenine was detected in cultures of unpurified DCs or culture of CDllc- cells, we only detected kl,nurenine in cultures of CD 1 1 ci cells. In this study we established that the tolerance generated by the 4hLPS/D Cs in-vivo, is not generated by the §ptophan metabolism, and that the mechanism for the immune suppression of this cells remains to be established outside the context of this thesis.