Estudio genético, funcional y regulatorio de la ruta del mevalonato de Xanthophyllomyces dendrorhous

Abstract

La biosíntesis de isopreno, compuesto de cinco carbonos, es esencial para la vida de eucariontes ya que se utiliza en múltiples funciones celulares como la prenilación de proteínas, síntesis de ubiquinonas y la formación de esteroles. Esta molécula también es utilizada en la biosíntesis de metabolitos secundarios de interés comercial. En eucariontes, el isopreno se obtiene a partir de la rula del mevalonato, la que ha sido mayormente estudiada en mamíferos dada su importancia en la sintesis de colesterol. La ruta del mevalonato comprende seis pasos, cada uno catalizado por una enzima diferente. Xanthophyltomyces dendrorhous es una levadura que sintetiza carotenoides, derivados del isopreno, con astaxantina como principal producto. El interés en el estudio de esta levadura se ha desarrollado principalmente debido a la aplicabilidad de los carotenoides como pigmentos y antioxidantes en las industrias piscícolas y farmacéuticas. Por este motivo, la mayor parte de los estudios desarrollados en X dendrorhous han sido enfocados en conocer y mejorar las vías de síntesis de estos pigmentos; sin embargo, el conocimiento de la síntesis de sus precursores aún es limitado. En este trabajo, los genes de la ruta del mevalonato ERG10B, HMGS, MVK, PMK y MVD, fueron identificados en el genoma de la cepa UCD 67-385 de X. dendrorhous, observando que las proteínas codifcadas por cada uno de ellos mantienen características conservadas en sus respectivas familias a nivel de secuencia. También se identificó el gen ERG70A, que estaría relacionado evolutivamente con el gen ERG10B, pero formaría parte de la ruta de B-oxidación de ácidos grasos. Se confirmó la funcionalidad de los genes ERG10B, HMGS y MVK por complementación heteróloga de cepas de S. cerevisiae mutantes. Las cepas de S. cerevisiae portadoras de cada gen de la ruta del mevaionalo de X. dendrorhous mostraron un crecimiento similar a las cepas parentales y mantuvieron la producción de esteroles, indicando que los genes codifican proteínas con las funciones esperadas. Se construyó mutantes heterocigotas de X. dendrorhous para evaluar el efecto sobre la síntesis de pigmentos. Para el gen ERG10A también se obtuvo una mutante homocigota que presentó un cambio en la proporción de pigmentos producidos, produciendo menos astaxantina que la cepa parental. Se midió la expresión del gen ERGI0B en esta mutante y se encontró que había 8 veces más transcrilo que en el control, además el nivel de transcrito del gen crts, que codifca la enzima que cataliza el último paso en Ia síntesis de astaxantina, fue 4 veces menor que el control. La cepa mutante heterocigota del gen ERG708 no mostró cambios significativos en la producción de esteroles ni carotenoides en comparación con la cepa parental. En cambio, la cepa mutante heterocigota del gen MVK presentó un cambio en la composición de carotenoides, exhibiendo una disminución en el porcentaje de astaxantina. A nivel transcripcional se encontró que la mutación del gen MVK produce una disminución de la cantidad de transcrito de 4 veces en comparación con la cepa parental. Además, se observó una disminución de 4 veces en Ia cantidad de transcrito del gen crtr que participa de las rutas de sÍntesis de carotenoides y esleroles. Finalmente se analizó el efecto de la adición de glucosa y etanol a nivel transcripciona de los genes de la ruta del mevalonato en cultivos de X. dendrorhous. La transcripción del gen HMGS mostró un aumento en ambos casos que luego de 24 h recuperó las cantidades control. En el caso del gen ERG70A se observó que la cantidad de transcrito disminuye drásticamente por la adición de glucosa a los cultivos, de forma similar a la represión catabólica. En un mutante de X. dendrorhous que no produce ergosterol, se encontró una respuesta común en los genes de la ruta del mevalonato, teniendo un aumento en la cantidad de transcrito en cultivos en fase estacionaria en comparación con una cepa silvestre. Como parte de este resultado destacó el gen HMGS, cuyo transcrito aumentó 45 veces en comparación a cultivos de la cepa control, En resumen se identificó los genes de la ruta del mevalonato de X. dendrorhous y se caracterizó funcionalmente los genes ERG10B, HMGS y MVK. En relación a la regulación de sus transcritos destaca el gen HMGS, que se vió afectado en todas las condiciones estudiadas, sugiriendo que constituye un punto importante en la regulación de esta ruta que puede ser utilizado en futuros estudios para mejorar la síntesis de isopreno.

The b¡ological synthesis of isoprene, a C5 molecule, is essent¡al for eukaryotes as it is used for multiple cellular functions (e.9. prote¡n prenylation, ubiquinone synthesis and sterol formation). This molecule is also used for producing secondary metabolites of commercial interest. ln eukaryotes isoprene is synthesized through the mevalonate pathway, which has been extensively studied because of its importance in cholesterol synthesis ¡n mammals. Xanthophy omyces dendrothous is a carotenoid-synthesizing yeast that produces astaxanth¡n as main product. The interest in study¡ng this yeast was developed mostly because of the applications of carotenoids in f¡sher¡es and pharmaceuticals due to the¡r ant¡ox¡dant and pigmentation properties. For these reasons, most studies performed w¡th the yeast have focused on gaining knowledge to ¡mprove p¡gment synthesis, whereas ¡nformation on thelr precursors product¡on ¡s st¡ll lim¡ted. ln th¡s work, ERG10B, HMGS, MVK, PMK and MyD genes, controll¡ng the mevalonate pathway, were identif¡ed in the genome of wild-type X. dendrorhous strain UCD 67-385. It was noted that sequence features common to the¡r protein families were conserved in proteins encoded by these genes kept conserved. The gene ERG10A, evolutionarily related to ERG10B, but part of the fatty acids g-oxidation pathway, was also found. The functionality of genes ERG1?B, HMGS and MVK was assessed by heterologous complementation of S. cereylsiae mutant strains. The complemented strains showed similar growth and sterol production to the parental strain, provid¡ng confirmation that each gene encodes a protein with the expected activity. dendrorhous' heterozygous mutants were constructed to evaluate the effect of mutat¡on on carotenoid synthes¡s. A homozygous mutant was also obtained for the ERGI0A gene, which showed changes ¡n the proport¡on of ditferent carotenoids, mainly a decrease in astaxanthin amounts. Transcript levels were assesed for th¡s mutant, flnd¡ng a 8-fold increase in the quantity of ERGlOB transcript compared to the parental strain, Transcr¡pts for crfs were also measured f¡nding a 4-fold decrease. The ergl0B- heterozygous mutant showed no s¡gnificant changes in sterol or carotenoid product¡on as compared to the parental strain. However, lhe mvK heterozygous mutant presented modifications in p¡gment composition with a decrease of astaxanthin. By measuring transcript levels it was found that the MyK transcript decreased 4-fold in relation to the parental strain. Also, a 4-fold decrease for crfR gene transcript, which participates in sterols and caroteno¡ds b¡osynthesis, was found. Finally, the effect of glucose or ethanol addition to X. dendrorhous' cultures on transcript levels of the mevalonate pathway genes was analyzed. HMGS showed a common response for both compounds, displaying an increase in transcript levels that went back to basal amounts after 24 h. A decrease in transcripts after glucose addit¡on was found for gene ERGIoA, behaving similarly to catabolic repression. Transcr¡pt levels were also measured and compared to a wild-type X. dendrorhous strain that does not produce ergosterol, The effect of lack of ¡ntracellular ergosterol was similar for all the mevalonate pathway genes, with an increase in transcripts in stationary-grow¡ng cultures. Among these results, the HMGS gene outstands by having a 45jold increase in the mutant as compared to the control stra¡n. Summarizing, the mevalonate pathway genes of X. dendrorhous were identified and the functionality of genes ERG10B, HMGS and MVK was assessed. Regarding transcriptional regulation, it was found that HMGS transcript level was affected in all stud¡ed conditions, suggesting that this gene represents an ¡mportant regulatory step of the mevalonate pathway ¡n dendrorhous, which could be important in future studies for isoprene synthesis improveme