Implementación de un sistema pseudoviral que permita determinar anticuerpos neutralizantes contra los coronavirus estacionales

Abstract

Cuatro coronavirus de dos géneros distintos son endémicos en los humanos: dos alfacoronavirus (NL63 y 229E) y dos betacoronavirus (OC43 y HKU1), causan frecuentemente enfermedades leves del tracto respiratorio superior y han estado circulando en los humanos como virus estacionales. Las infecciones son comunes en todos los grupos de edad, sin embargo, son más altas en niños y adolescentes. Los Coronaviridae son una familia de virus con genoma de ARN monocatenario de sentido positivo de aproximadamente 27 a 32 kilobases. La glicoproteína spike (S) de los coronavirus humanos (HCoV) está expuesta en la superficie, y desempeña un papel clave para la entrada viral a la célula hospedera, convirtiéndose en el principal sitio de antigenicidad. Por ende, es uno de los objetivos de los anticuerpos neutralizantes (NAbs) tras la infección viral. Los NAbs contra los HCoV estacionales son comunes en los humanos debido a las infecciones repetidas en el tiempo. Los estudios epidemiológicos han descrito que la seroconversión se produce a menudo en la infancia y la seroprevalencia puede alcanzar más del 90% para los cuatro HCoV estacionales en los adultos. El objetivo de esta tesis fue implementar un sistema pseudoviral que permitiera determinar anticuerpos neutralizantes contra el coronavirus estacional 229E. Para ello, se generó un pseudotipo viral basado en VIH-1 que contiene en su membrana la glicoproteína spike del HCoV estacional 229E, el que, para analizar su infectividad, fue transducido en células HEK293T-ACE2 y Huh-7, observando una mejor transducción en las células Huh-7 debido al nivel de expresión de los receptores celulares de aminopeptidasa N, siendo este el principal receptor celular necesario para la entrada viral. Posteriormente, el pseudotipo HCoV 229E y SARS-CoV-2, como control, fueron utilizados para medir la cantidad de anticuerpos neutralizantes en sueros de pacientes adultos extraído previo a la pandemia del COVID-19. En las que se observó 8 de 19 muestras con la presencia de anticuerpos neutralizantes contra el HCoV 229E y ninguna contra SARS-CoV-2. El título de anticuerpos neutralizantes fue calculado detectando el 50% de la dosis inhibitoria (ID50) con valores desde 43,47 hasta 756,8, con un promedio de 258,4. Paralelamente, se analizaron muestras pediátricas de donantes diagnosticados con coronavirus estacional, observando que el 13% (2/15) de ellas se pudo detectar la neutralización para el pseudotipo viral HCoV 229E. En conclusión, se caracterizó y optimizo la producción del pseudotipo viral basados en VIH- 1 para la glicoproteína spike del coronavirus estacional 229E la que representó una

herramienta útil para estudiar las respuestas neutralizantes en individuos infectados naturalmente y los resultados de este proyecto permitieron comparar los títulos de anticuerpos neutralizantes detectados contra el pseudotipo viral HCoV 229E. Este modelo puede permitir comparar la neutralización de anticuerpos de no solo los coronavirus, sino, además, de virus de preocupación publica; ayudando a responder preguntas críticas de investigación y a entender la inmunidad frente a estos patógenos.

Four coronaviruses of two distinct genera are endemic in humans: two alphacoronaviruses (NL63 and 229E) and two betacoronaviruses (OC43 and HKU1) frequently cause mild upper respiratory tract disease and have been circulating in humans as seasonal viruses. Infections are common in all age groups, however, they are highest in children and adolescents. The Coronaviridae are a family of viruses with a single-stranded positive-sense RNA genome of approximately 27 to 32 kilobases. The spike (S) glycoprotein of human coronaviruses (HCoV) is exposed on the surface, and plays a key role for viral entry into the host cell, becoming the main site of antigenicity. It is therefore one of the targets of neutralizing antibodies (NAbs) following viral infection. NAbs against seasonal HCoV are common in humans due to repeated infections over time. Epidemiological studies have described that seroconversion often occurs in childhood and seroprevalence can reach more than 90% for the four seasonal HCoVs in adults. The aim of this thesis was to implement a pseudoviral system to determine neutralizing antibodies against seasonal coronavirus 229E. For this purpose, a viral pseudotype based on HIV-1 containing in its membrane the spike glycoprotein of seasonal HCoV 229E was generated, which, to analyze its infectivity, was transduced in HEK293T-ACE2 and Huh-7 cells, observing a better transduction in Huh-7 cells due to the level of expression of the cellular receptors of aminopeptidase N, being this the main cellular receptor necessary for viral entry. Subsequently, the pseudotype HCoV 229E and SARS-CoV-2, as a control, were used to measure the amount of neutralizing antibodies in sera of adult patients extracted prior to the COVID-19 pandemic. In which 8 of 19 samples were observed with the presence of neutralizing antibodies against HCoV 229E and none against SARS-CoV-2. The neutralizing antibody titer was calculated by detecting 50% of the inhibitory dose (ID50) with values ranging from 43.47 to 756.8, with an average of 258.4. In parallel, pediatric samples from donors diagnosed with seasonal coronavirus were analyzed, observing that 13% (2/15) of them could detect neutralization for the HCoV 229E viral pseudotype. In conclusion, we characterized and optimized the production of the HIV-1 based viral pseudotype for the spike glycoprotein of seasonal coronavirus 229E which represented a useful tool to study the neutralizing responses in naturally infected individuals and the results of this project allowed to compare the titers of neutralizing antibodies detected against the HCoV 229E viral pseudotype. This model may allow the comparison of neutralizing antibodies not only to coronaviruses, but also to viruses of public concern, helping to answer critical research questions and to understand immunity to these pathogens.