Estudios funcionales y estructurales de la triptofanil tRNA sintetasa de Acidithioobacillus ferrooxidans

Abstract

Las aminoacil tRNA sintetasas (aaRS) son enzimas claves para asegurar la fiel traducción del código genético. Estas enzimas unen el aminácido al extremo 3' del tRNA correspondiente. La aminoacilación del tRNA por las sintetasas ocurre en una reacción de dos etapas, la activación del aminoácido con ATP y la transferencias del aminoácido activado al extremo 3' del tRNA. Las aaRS tienen dos dominios principales, el dominio de activación o dominio catalítico y el dominio de unión al anticodón. En base a la estructura común del dominio de activación, las aaRS han sido divididas en dos clases, clase I y clase II, en las cuales el sitio activo de estas enzimas está formado por un dominio de hojas b paralelas, separadoas por hélices a (plegamiento de Rossmann) y un dominio de hojas b antiparalelas respectivamente. Dentro de estos dominios, cada clase presenta secuencias características (HIGH y KMSKS para la clase I y los segmentos 1, 2 y 3 para la clase II). Sobre la base de estas secuencias caracteristicas y la estructura del plegamiento de Rossmann, el dominio de activación de las aaRS de clase I se encuentra separado en dos mitades por la presencia de dos secuencias idiosincráticas denominadas péptido conector 1 y péptido conector 2. Se ha mostrado que el péptido conector 1 (PC1) está involucrado en la edición de aminoácidos erróneamente cargados en la IleRS, así como en la unión específica del tRNAtyr en TyrRS de eucariontes y bacterias, aunque el PC1 es dispensable para la actividad de la IleRS. Recientemente se ha demostrado que la PC1 de la MetRS de levadura citoplásmatica contiene un subdominio de dedo de zinc, donde la unión del zinc es esencial para la función de la MetRS citoplasmática. Hasta el momento, no se le ha asignado ninguna función al PC2 de las aaRS de clase I. En este trabajo se reporta la secuencia y el análisis funcional de la Triptofanil tRNA sintetasa de la bacteria acidofila Acidithiobacillus ferrooxidans. En el dominio de activación de las TrpRS de arqueas y bacterias casi no se reconoce el PC2. En caso de At. ferrooxidans, la proteína deducida a partir del gen trpS contiene un PC2 inusualmente largo. Un PC2 similar fue encontrado en las TrpRS de algunas arqueas de la familia Euriachaeota. Para probar la función del PC2 de la TrpRS de At. ferrooxidans, se realizó la deleción de un segmento del gen trpS que codifica 65 residuos del PC2 y la función de la enzima recombinante se analizó tanto in vivo como in vitro en E. coli. Aunque la TrpRS delecionada fue tan activa como la silvestre en la activación del aminoácido, la afinidad por el tRNA específico se redujo, implicando una posible función en la unión del tRNA. Se realizó el modelamiento de la estructura terciaria de la TrpRS, el que sugiere que el PC2 no causa distorciones de la estructura evolutivamente más conservada

Aminoacyl tRNA synthetases are the key enzymes to ensure the faithful translation of the genetic information. These enzymes bind each amino acid at the 3’ end of the cognate tRNA. The aminoacylation of tRNA by the synthetases occurs in a two step reaction, the first being the activation of the amino acid with ATP and the second, the transfer of the activated residue to the 3’ end of tRNA. The aaRS has two principal domains, the activation or catalytic one and the anticodon binding domains. Based on the common structure of the activation domain, aaRS are divided in two classes, class I and class II in which a parallel b sheet limited by a helices at both ends (Rossmann fold) and an antiparallel b sheet conform the active sites respectively. Within these domains, signature sequences are present for each class (HIGH and KMSKS for class I and motifs 1, 2 and 3 for class II). Besides the conserved signature motifs and structure of the Rossmann fold, the activation domain of aaRS is generally separated into two halves by the presence in many cases of two idiosyncratic sequences, named connective peptides 1 and 2. It has been shown that connective peptide 1 is involved in editing of the mischarged amino acids in IleRS as well as in tRNA binding specificity among eukaryal and bacterial TyrRS. In spite of the functions described for CP1, this from IleRS is dispensable for the activity of the enzyme. Recently, it was demonstrated that CP1 from yeast cytoplasmic MetRS contains a zinc-finger subdomain that binds one zinc ion and this binding is essential for the function of cytoplasmic MetRS. To date, no function has been assigned to CP 2 of class I aaRS. In this work, a sequence and functional analysis of tryptophanyl tRNA synthetase from the acidophilic bacterium Acidithiobacillus ferrooxidans is reported. The activation domain of bacterial and eukaryal TrpRS contains an almost non-recognizable CP2. In the case of A. ferrooxidans, the predicted protein encoded by the trpS gen contains an unusually long CP 2. A similar or even longer CP2 is also found in TrpRS from several archaeas of the family euryarchaeota. To test for the function of CP2 in At. ferrooxidans TrpRS, the nucleotide sequence encoding 65 residues of CP2 was deleted and the function of the resulting recombinant enzyme was analyzed either in E. coli in vivo or in vitro. Although the deletedTrpRS was fully active in the activation of tryptophan, the affinity of the cognate tRNA was reduced implying a possible function of CP 2 in the binding of tRNA. Modelling of the tertiary structue of TrpRS suggested that CP 2 causes no distorsion of the evolutionary more conserved structure of TrpRS.