Expresión de canales de calcio activados por voltaje en el desarrollo temprano de pez-cebra (danio rerio)

Abstract

El Ca+2, mediante su interacción con múltiples proteínas, es componente importante de fenómenos como la excitabilidad de células y el desarrollo embrionario de vertebrados. Un tipo de proteínas encargadas de su transporte son los canales de calcio activados por despolarización (CaV), los cuales inicialmente fueron clasificados por sus propiedades electrofisiológicas en tres grupos: CaV tipo-L, CaV tipo-T y CaV tipo neuronal (tipo-N, tipo-P/Q y tipo-R). Los CaVs son un complejo proteico conformado por 4 subunidades: alfa (CaVa1), beta (CaVB), alfa2delta (CaVq20) y gama (CaVy). El componente principal de ese complejo es la subunidad CaVa1 la cual posee el poro que conduce al ion calcio, y la capacidad de detectar el voltaje. CaV es una proteína de entre 190-250 kDa. que posee cuatro dominios transmembrana homólogos, cada uno compuesto por seis segmentos transmembrana. El conocimiento molecular de las secuencias que codifican los diferentes tipos de CaVa1 ha permitido clasificar filogenéticamente a las CaVa1, generándose tres familias: CaV1 (tipo-L), CaV2 (tipo neuronal) y CaV3 (tipo-T). Durante el desarrollo temprano de vertebrados, elevaciones transitorias de calcio toman la forma de ondas que se propagan y que constituirían una señal requerida para procesos como citocinesis y reordenamiento del citoesqueleto. También ha sido demostrada la participación de CaVa1 en tapas temprana del desarrollo, controlando procesos como el destino dorso-ventral del mesodermo. En etapas más tardías, se ha demostrado su papel en la diferenciación celular y organogénesis de pez-cebra, entre otros vertebrados.

Estos antecedentes motivaron la búsqueda de la expresión de otros CaV de pez-cebra durante su desarrollo embrionario. Se recopilaron secuencias aminoacídicas de CaVa1 de ratón y pez-cebra, se compararon entre sí y se obtuvo un consenso aminoacídico representativo de las zonas conservadas de CaVa1. Esta secuencia consenso fue ingresada como consulta en la base de datos de Ensembl, para encontrar secuencias homólogas en el genoma de pez-cebra, mediante el algoritmo BLAST. Posteriormente se diseñaron partidores específicos para cada secuencia homóloga encontrada y se analizó su expresión en juveniles (2 meses), y en embriones tardíos (25 y 35 hpf.) y tempranos (75% epibolia). Se observó la expresión de'10 secuencias homólogas a CaVa1 en pez-cebra juvenil. En embriones, el patrón de expresión varía de acuerdo al tiempo de desarrollo. Se detectó la presencia de al menos 5 tipos de mRNA codificante para CaVa1 durante

el periodo de gastrulación.

Se analizó el patrón de expresión espacial de tres de estos mRNA mediante

hibridación in-situ. En embriones de 48 hpf. se observa marca en las zonas correspondiente al sistema cardiovascular, nervioso y locomotor en desarrollo. Sin embargo, debido a la similitud entre la marca de las sondas anti sentido y sentido (control), no fue posible determinar este patrón espacial de expresión con certeza. Posteriormente se analizó mediante inmunofluorescencia la presencia de la proteína CaVa1 usando un anticuerpo "pan CaVa1 en células embrionarias en cultivo, con desarrollo equivalente al término de la gastrulación. Se observó una intensa marca, lo que confirma la traducción de al menos uno de los mRNA detectados por RT-PCR durante el desarrollo temprano de pez-cebra.