Remoción y detección de endotoxinas desde soluciones proteicas nativa y recombinante : aplicación de un método de inmunoafinidad /

Abstract

Los lipopolisacáridos (LPS) o endotoxinas bacterianas, son contaminantes de muchas proteinas purificadas, en particular recombinantes derivadas de E. coli. El LPS es altamente pirogénico, ya que induce la liberación de TNFo por parte de una variedad de células, principalmente macrófagos. Para remover LPS de las preparaciones biológicas se han desarrollado técnicas tales como ultrafiltración, extracción en dos fases, cromatografÍa de intercambio aniónico, etc., con efectividad limitada. Hemos generado sueros de conejos (lapinos) anti-LPS, para montar una columna de extracción por inmunoafinidad, junto con un método de detección y cuantificación de LPS en muestras problemas por ELISA y por lWB. Las inmunoglobulinas G lapinas fueron precipitadas y purificadas desde los sueros policlonales y mediante ELISA de competencia fue posible la detección de LPS, con una sensibilidad de 31,3 ng/ml, similar a la obtenida mediante lWB, aunque con un menor costo en ésta. Con las inmunoglobulinas purificadas se montó una columna cromatográfica en Sefarosa activada con bromuro de cianógeno. En esta columna se ensayó la capacidad de remoción de LPS presente en dislintas soluciones de concentración conocida de endotoxina y en preparaciones de proteínas recomblnantes. La eficiencia de extracción de LPS fluctuó entre total y parcial, dependiendo de la presencia de proteínas. Las pérdidas de proteínas acompañantes variaron entré 1O%. y 45%, dependiendo de las características de éstas.