Caracterización funcional del gen carotenogénico licopeno [Beta]-ciclasa 2 (Dclcyb2) de Daucu carota (zanahoria) mediante expresión en sistemas heterólogos

Abstract

Los carotenoides son compuestos isoprenoides lipídicos sintetizados por todos los organismos fotosintéticos y también por algunas bacterias, levaduras y áfidos. En las plantas, estos compuestos son sintetizados en los plastidios y son esenciales en procesos como la fotosíntesis, la fotoprotección y la síntesis de fitohormonas. En los animales, los carotenoides actúan como moléculas antioxidantes y también como precursores de vitamina A cuando se incorporan en la dieta. Actualmente, la ruta de biosíntesis de los carotenoides está bien caracterizada y es altamente conservada en plantas, donde se han identificado las enzimas más importantes de esta vía. Hasta la fecha, se sabe que el principal mecanismo regulador de la ruta carotenogénica se produce a nivel transcripcional, donde factores activadores como la luz y el desarrollo tienen un efecto directo en la activación de la expresión génica carotenogénica . La licopeno p-ciclasa (LCYB) es una enzima clave implicada directamente en la síntesis de los carotenoides q-caroteno y B-caroteno a través de la ciclación de licopeno. En Daucus carota (zanahoria), el modelo de estudio utilizado en nuestro laboratorio, los carotenoides se producen tanto en las hojas como en las raíces de reserva, siendo en este último órgano donde se acumulan las más altas cantidades de q-caroteno y B-cároteno. En algunas plantas modelo, la presencia de diferentes isoformas de los genes carotenogénicos está asociada a una función órgano-específica. D. carota alberga dos genes Lcyb: DcLcyb1 y DcLcyb2 de los cuales DcLcyb2 se expresa principalmente en las raíces de almacenamiento de plantas adultas de zanahoria, en correlación con los niveles más altos de carotenoides detectados en esta etapa del desarrollo

En este trabajo, mostramos que DoLCYB2 se localiza en los cloroplastos, y que es una enzima funcional, como se demuestra por complementación heteróloga en Escherichia coli y mediante la expresión estable en Nicotiana tabacum (tabaco)- Se observó que las plantas transgénicas con los niveles más altos de DcLcyb2 incrementaron los niveles de B-caroteno, carotenoides totales y clorofila en las hojas, sin embargo no se observaron cambios significativos en el contenido o en la composición porcentual de los carotenoides totales. Mediante el uso de pCR cuantitativo también se determinó el efecto de la sobreexpresión de DcLcyb2 en los niveles de expresión de tres genes endógenos carotenogénicos claves (Ntpsyl, Ntpsy2 y Ntlcyb) en líneas de tabaco transgénicas. Se observó un efecto activador del gen DcLcyb2 en dos de los genes estudiados (Ntpsyl y Ntpsy2),lo que sugiere un efecto regulador de este gen en la ruta de biosíntesis de carotenoides en tabaco mediante mecanismos de retroalimentación a nivel transcripcional. Nuestros resultados demostraron la funcionalidad in vivo del gen DcLcyb2 en la planta modelo Nicotiana tabacum indicando su importancia tanto en la expresión de genes carotenogénicos como en la acumulación de carotenoides