Optimización electrostática de aminoácidos para dimerización de dominios: concepto Magnet aplicado al interruptor optogenético Fungal Light-Oxygen-Voltage

Abstract

Los fotorreceptores son moléculas que surgen como un mecanismo biológico de percibir la luz, provocada por cambios conformacionales que estas moléculas sufren en respuesta a diversas longitudes de onda. Su nivel de respuesta y la capacidad de inducir señales de transcripción ha llevado al surgimiento de la optogenética, disciplina que combina estos receptores para controlar diversos procesos celulares de interés, permitiendo una fina modulación espaciotemporal de expresión de genes, en contraste con inducciones químicas que tienen mayores complejidades. Dentro la amplia gama de fotorreceptores se encuentran los dominios Light-oxygen-voltage (LOV), caracterizados por su pequeño tamaño, la capacidad de dimerizar entre sí y su sensibilidad a luz azul. En el hongo Neurospora crassa se han descrito dos proteínas con dominios LOV, White collar-1 (WC-1) y Vivid (VVD), que juegan un importante rol en la fotobiología de este organismo, y que recientemente han además sido utilizadas para el desarrollo de sistemas optogenéticos. En su estado natural, WC-1 dimeriza en presencia de luz y permite activar una serie de procesos transcripcionales dentro de los que se encuentra la expresión de VVD, que a su vez inhibe –por competitividad– el sistema a partir de su interacción con WC-1. Ambas proteínas se han utilizado conjuntamente en la implementación de un interruptor optogenético basado en el sistema de doble híbrido (Y2H), Fungal Light-Oxygen-Voltage (FUN-LOV). Este interruptor utiliza el dominio de unión a ADN de Gal4 fusionado a WC-1, y el dominio de activación de Gal4 unido a VVD, permitiendo la activación de genes de interés en presencia de luz azul. Esta herramienta optogenética destaca por su alta resolución temporal, su alto nivel de inducción y su bajo nivel de ruido basal, transformándose en sistema robusto para el control de expresión génica. Por su parte, VVD se ha utilizado para reconstituir función de proteínas divididas (Split), que se encuentran fusionadas quiméricamente cada una a una unidad de este dominio LOV, de forma tal que mediante luz VVD dimeriza permitiendo que una mitad de la proteína dividida quede junto a la otra. Este sistema ha sido aplicado extensivamente pero no está exento de problemas, en particular la homodimerización de partes. A partir de esta disyuntiva es que se ha desarrollado el sistema de optimización Magnet, que reemplaza ciertos aminoácidos neutros de VVD por otros cargados, generando una interacción electrostática de cargas opuestas, permitiendo selectividad de las partes del sistema y una unión más persistente. Este seminario de título combina el sistema FUN-LOV y la optimización Magnet, utilizando aminoácidos cargados sobre la región original de VVD y la región homóloga de WC-1, con el fin de reducir la homodimerización de ambas partes del interruptor original. Esta optimización se caracterizó tanto in vivo mediante la activación de un gen reportero, así como in silico, mediante el uso de la novedosa herramienta de predicción de estructura AlphaFold. Para este propósito, se desarrollaron variantes de las partes del sistema FUN-LOV conteniendo aminoácidos con carga positiva y negativa, y se evaluaron estos cambios mediante la luminiscencia del gen reportero de luciferasa. Como resultado de esta caracterización, no se pudo recapitular la interacción electrostática original del sistema Magnet. Sin embargo, algunas variantes del sistema entregaron mayores niveles de inducción. En particular, esto ocurrió en los cambios de aminoácido sobre WC-1, sobre todo aquellos con carga negativa, teniendo estas variantes mayor respuesta a luz. La caracterización in silico demostró que los aminoácidos cambiados de WC-1 son relevantes y alteran su estructura homodimérica, lo que teóricamente podría permitir una mejor interacción con VVD, aumentando su nivel de respuesta.

Photoreceptors are molecules that arise as a biological mechanism of light sensing, provoked by conformational changes that these molecules undergo in response to various wavelengths. Its level of response and its capacity to induce transcription signals has led to the emergence of optogenetics, a discipline that combines these receptors to control various cellular processes of interest, allowing a fine spatiotemporal modulation of gene expression, in contrast to chemical inductions which have greater complexities. Within the vast range of photoreceptors are the domains Light-oxygen-voltage (LOV), distinguished by their small size, their capacity to dimerize with each other and their sensitivity to blue light. Two proteins containing LOV domains have been described in the fungus Neurospora crassa, White collar-1 (WC-1) and Vivid (VVD), which play an important role in the photobiology of this organism, and which have also recently been used for the development of optogenetic systems. In its natural state, dimers of WC-1 are formed in presence of light, allowing a number of transcriptional processes to occur, including VVD expression which, when produced, inhibits the system by competing with its interaction with WC-1. Together these proteins have been used in a recently described switch based on the two-hybrid system (Y2H), Fungal Light-oxygen-voltage (FUN-LOV). This switch uses DNA binding domain of Gal4 attached to WC-1, and the activation domain of Gal4 attached to VVD, allowing the activation of genes of interest in the presence of blue light. This optogenetic tool stands out by its high temporal resolution, high level of induction and low noise level, thus becoming a robust system for the control of gene expression. For its part, VVD has been used to reconstitute the function of divided proteins (Split), which are fused to this LOV domain, in a way that VVD dimerizes by light, allowing one half of the divided protein to remain close to the other. This system has been applied extensively but it is not without its flaws, in particular the homodimerization of its parts. It is from this dilemma that the Magnet optimization system was developed, which replaces certain neutral aminoacids in VDD with charged ones, generating electrostatic interaction between opposed charges, allowing selectivity between the parts of the system and a more persistent union. The present Pre-graduation seminar combines the FUN-LOV system and a Magnet optimization, using charged aminoacids on the original region of VVD and the homologous region of WC-1, in order to reduce the homodimerization of both parts of the original switch. This optimization was characterized both in vivo by activation a reporter gene, as well as in silico, using the novel AlphaFold structure prediction tool. For this purpose, variants of the parts of the FUN-LOV system containing positively and negatively charged aminoacids were developed and were evaluated by the luminescence of the luciferase reporter gene. As a result of this characterization, the original Magnet electrostatic interaction could not be recapitulated. However, the system was optimized by the aminoacids changes over WC-1, especially those with a negative charge, having these variants greater response to light. In silico characterization demonstrated that the changed aminoacids from WC-1 are essential and alter its homodimeric structure, which theoretically could allow a better interaction with VVD, increasing its response level.