Caracterización de los genes que codifican para las proteínas de estrés térmico Hsp60 y Hsp70 de Piscirickettsia salmonis y su uso potencial para la formulación de una vacuna

Abstract

La industria salmonera en Chile se ha convertido en una importante actividad económica contribuyendo con el crecimiento y desarrollo del país. Sin embargo, las enfermedades de peces que afectan el desarrollo de esta actividad han generado grandes pérdidas económicas. Uno de los patógenos responsables es Piscirickettsia salmonis, causante del Síndrome Rickettsial Salmónideo (SRS). Esta enfermedad afecta a gran parte de los cultivos intensivos del país y es por esto que se han desarrollado técnicas de diagnóstico y se ha tratado de controlar la enfermedad mediante el uso de antibióticos y vacunas. No obstante, no se ha tenido éxito. Las proteínas de estrés térmico han sido consideradas como antígenos principales en la respuesta inmune y se han utilizado como vacunas en diversos ensayos con alto grado de éxito. Por esta razón, el objetivo de esta tesis fue identificar, clonar, caracterizar y expresar los genes de las proteínas de estrés térmico 60 (hsp60) y 70 (hsp70) de P. salmonis con el objeto de desarrollar una potencial vacuna contra el SRS. Ambos genes fueron clonados en el vector pGEM-T, los vectores de expresión eucarionte pUK21-A2, pCMV-Bios y el vector de expresión procarionte pET32a(+). Los genes fueron secuenciados y expresados en E. coli Origami, logrando obtener las proteínas recombinantes Hsp60 y Hsp70, que fueron posteriormente purificadas y utilizadas para elaborar una vacuna recombinante, la cual fue ensayada en ratones Balb/c, generándose una respuesta inmune anti-Hsp60 y anti-Hsp70. Por otro lado, se inmunizaron ratones Balb/c con los genes hsp60 y hsp70 clonados en el vector pUK21-A2. La respuesta inmune generada por esta vacuna fue medida por ELISA, detectándose una respuesta inmune sólo en ratones vacunados con el vector pUK21-A2 + hsp70. Además, ambas proteínas recombinantes fueron utilizadas para evaluar la presencia de anticuerpos anti-Hsp60 o anti-Hsp70 en ratones inmunizados con la vacuna de ADN o con la vacuna recombinante mediante"Western blot". De esta manera, se detectaron anticuerpos que reconocen tanto a Hsp60 como a Hsp70 en sueros de ratones inmunizados con las vacunas de proteína recombinante y también fue detectada la presencia de anticuerpos en el suero de ratones inmunizados con el vector de expresión pUK21-A2 + hsp70, lo cual indica que este gen clonado en el vector eucariótico se expresa in vivo. Finalmente, a través de anticuerpos monoclonales antiHsp60 y anti-Hsp70, desarrollados en BiosChile 1.G.S.A, se demostró la existencia de estas proteínas en extractos de P. salmonis indicando que estos genes efectivamente son expresados por el patógeno.

The Salmon industry has become in a important economic activity wich contributes to the growth and the development of Chile. However, the diseases that affect the development of this activity have caused catastrophic economic loses. One of the pathogens responsible for this is Piscirickettsia salmonis which causes the Septicemial Rickettsial Syndrome (SRS). This disease affects most salmon cultures in Chile and for this reason diagnostic techniques have been developed. Antibiotics and vaccines has failed in the attempt to control the diseases. The heat shock proteins are considered the principal antigens to obtain an immune response and these have been used as vaccines in different of models with a high degree of success. The objective of this work was the identification, cloning, characterization and the expression of the heat shock protein genes hsp60 and hsp70 of P. salmonis, order to develop a vaccine against the SRS. Both genes were succesfully cloned in the pGEM-T vector, the pUK21-A2 and pCMV-Bios eukaryotic expression vectors and in the PET32a(+) procariontes expression vector. The genes were sequenced and expressed in E. coli Origami, obtaining the recombinant proteins Hsp60 and Hsp70. These proteins were purified tested as recombinant vaccines in mouse Balb/c where an immune response was generated against Hsp60 and Hsp70. In another set of studies Balb/c mice were immunizated using the hsp60 and hsp70 genes, cloned in the pUK21-A2 eukaryotic expression vector. The immune response generated by this DNA vaccine was determinate by ELISA which showed an immune response only in the mice vaccinated with pUK21- A2 + hsp70 vector. Western blotting detected the presence of Hsp60 and Hsp70 antibodies in serum of mice which had been immunized with the recombinant vaccines as well as in serum of mice vaccinated with pUK21-A2 + hsp70 eukaryotic expression vector, demonstrating that this gene cloning in the eukaryotic vector are expressed in vivo. Finally, using monoclonal antibodies against Hsp60 and Hsp70, we demonstrated the presences of these P. salmonis proteins witch indicates that these genes were indeed expressed by this pathogen.