Obtención de mutantes sobreproductoras de astaxantina en cepas antárticas de Xanthophyllomyces dendrorhous

Abstract

Xanthophyllomycesdendrorhous es una levadura basidiomicete que ha sido aislada desde 1960 en Japón, Rusia, Alaska, Finlandia, Estados Unidos y Chile. Esta levadura posee la capacidad de sintetizar el carotenoide astaxantina, un pigmento que tiene múltiples propiedades que la hacen interesante para la industria tanto en el sector agrícola como farmacéutico. La síntesis de astaxantina, se realiza en respuesta a la exposición a múltiples agentes, entre ellos, aquellos que causan estrés foto-oxidativo en sus células, principalmente los rayos UV, cuya acción es bloqueada por dicha molécula. Sin embargo, la producción de astaxantina en cepas silvestres es baja como para considerarse viable en términos de producción industrial, convirtiendose en una alternativa las técnicas basadas en el mejoramiento genético de cepas que producen de forma natural un mayor contenido de este carotenoide. En la XLVI Expedición Científica Antártica se recolectaron 34 muestras de tierra provenientes de la Isla Rey Jorge, territorio antártico, con la finalidad de aislar levaduras. Desde una de estas muestras, proveniente de la Península Barton, se lograron aislar 13 colonias llamadas ANCH01 a 13, que corresponden a la levadura X. dendrorhous. Interesantemente, luego de un análisis comparativo de su fenotipo morfológico de pigmentación, se observó que éstas producen mayor cantidad de carotenoides que cepas silvestres continentales aisladas de bosques del sur de Chile por nuestro laboratorio. De esta manera, el objetivo de este trabajo fue la obtención de mutantes sobreproductores de astaxantina, a partir de las cepas antárticas de X. dendrorhous, mediante mutagénesis al azar. A de los aislados y partir trece antárticos de X. dendrorhous, ANCH04 ANCH13, presentaron los mayores niveles de carotenoides, por lo que ajustándose a la producción de biomasa, éstos fueron los candidatos más idóneos para realizar mutagénesis al azar y así obtener cepas sobreproductoras de astaxantina. Los experimentos de mutagénesis al azar se realizaron connitrosoguanidina (NTG) o rayos gamma. Las curvas de sobrevida correspondientes a los tratamientos mutagénicos sugieren una mayor sensibilidad de la cepa ANCH04 (sobrevida baja) en comparación con ANCH13 a ambos mutágenos, resultando en una mayor variabilidad fenotípica de pigmentación en los mutantes obtenidos. Como resultados de los experimentos de mutagénesis al azar de los aislados ANCH04 y ANCH13, se obtuvieron colonias de distintos fenotipos de color (rojas pálidas, rojas intensas, naranjas, amarillas y blancas) que sobrevivieron al tratamiento mutagénico.Los resultados de los ensayos de mutagénesis sugieren que el agente físico radiación gamma fue más eficiente que el agente químico NTG. Luego de los tratamientos de mutagénesis, se aislaron 15 posibles mutantes mediante selección visual por tonalidades rojas intensas provenientes de la cepa parental ANCH13 y 10 candidatos provenientes de los ensayos de mutagénesis en la cepa ANCH04.Por lo tanto, se analizaron 25 mutantes candidatas, presentando la candidata ANCH13.14 una mayor producción de carotenoides totales (y de astaxantina en particular) luego de 120 h de cultivo en medio completo YM, respecto a su parental.

Xanthophyllomycesdendrorhousis a basidiomycetous yeast that has been isolated since 1960 in Japan, Russia, Alaska, Finland, United States and Chile. This yeast is able to synthesize astaxanthin, a carotenoid pigment that has multiple properties that make it interesting for aquiculture and pharmaceutical industry. The astaxanthin synthesis is made as a response to the exposure of multiple agents, among them, those that cause photo-oxidative stress in cells, especially UV rays whose action is blocked by this molecule. Nevertheless, astaxanthin production in wild-type strains is particularly low to be considered as viable in terms of industrial production, and good alternativesare those techniques based ongenetic improvement of strains that naturally produce higheramounts of this carotenoid. In the XLVI Antarctic Scientific Expedition, 34 soil samples from Rey Jorge Island were collected with the purpose of isolating yeasts. In one of these samples, taken from Barton Peninsula, 13 colonies named asANCH01 to ANCH13, wereisolated that corresponded to the yeastX.dendrorhous. Interestingly enough, after a comparative analysis of theirpigmentation phenotype, it could be observed that these isolates produce more carotenoids than continental wild-type strains isolated from southern Chile woods by our laboratory. Thus, the aim of the present work wasto obtainastaxanthin mutant hyperproducersstrains using random mutagenesis of the Х. dendrorhousAntarctic isolates. Among the 13 X. dendrorhousAntarctic isolates, ANCH04 and ANCH13 presented the highest levels of carotenoids. Therefore, and also considering the biomass production, these isolates were the most suitable candidates to perform random mutagenesis to obtain astaxanthin overproducing strains. Random mutagenesis experiments were carried out in the isolatespreviously selected, using N-Methlyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine(NTG) or gamma rays. The survival curves corresponding to the treatments with NTG and gamma radiation suggested thatANCH04 was more sensible thanANCH13 in these treatments and resulted in a wider phenotypical variety in the collected mutants. As a result of the random mutagenesis experiments, colonies with different colorphenotypes (pale red, intense red, orange, yellow and white) were collected. The outcomes of the mutagenesis analysis suggested that the gamma radiation was more efficient than the NTG chemical agent to obtain mutants.After mutagenesis treatments, 15 possible mutants were isolated by means of visual selection according to theirred tonalities in relation tothe parental strain ANCH13 and 10potential candidates from the mutagenesis of ANCH04.Therefore, 25 mutant candidates were analyzed. The candidate ANCH13.14 showed a higher production of total carotenoids (and astaxanthin) after 120 hours of culturein YM culture media, respect to its parental.