Uso de la ameba Dictyostelium discoideum para la búsqueda de moléculas antimicrobianas contra cepas virulentas y/o multiresistentes de Klebsiella pneumoniae

Abstract

La resistencia de los microorganismos a los antibióticos es un problema cada vez más relevante en salud pública debido a la aparición de cepas multirresistentes, el desarrollo tardío de los nuevos antimicrobianos efectivos y el aumento de la resistencia de los fenotipos hipervirulentos. Entre estos, el bacilo Gram negativo Klebsiella penumoniae ha sido declarado una amenaza a la salud global, principalmente por el surgimiento y diseminación de cepas multiresistentes e hipervirulentas. El objetivo del presente estudio es la implementación de una plataforma para evaluar la citotoxicidad de extractos naturales y la búsqueda de moléculas que presenten actividad de antivirulencia. La selección de los extractos debe presentar los siguientes criterios: 1.- No ser citotóxico en ensayos biológicos (Dyctiostelium discoideum) 2.- No matar a la bacteria patógena K. pпeuтоniae RYC 492. 3.- Interrumpir la producción de factores de virulencia del patógeno y que no dañen el desarrollo del hospedero. Los resultados de los extractos de diclorometano de las diferentes partes (flor, tallo-hoja y raíz) de la especie Helenium aromaticum fueron citotóxicos contra la ameba, retrasando su desarrollo social comparado con los extractos metanólicos que no resultaron citotóxicos alcanzando la fase de culminación con la formación de cuerpos fructíferos. En la evaluación antimicrobiana de los extractos de diclorometano y metanol no presentaron halos de inhibición contra la cepa patógeno K. pneumoniae RYC 492, cumpliendo de esta manera uno de los criterios propuesto que el extracto no sea un antibiótico. El extracto metanólico de raíz de la especie H. aromaticum fue el que cumplió con los 3 criterios: no ser citotóxico, no ser antibiótico y presentar actividad de antivirulencia. A partir del extracto metanólico de raíz se detectaron e identificaron mediante UHPLC-ESI-MS/MS 24 compuestos químicos; siendo en su mayoría 18 compuestos fenólicos (12 flavonoides, 3 ácido hidroxicinámico, 1 ácido fenólico y 2 ácidos orgánicos), que pueden ser responsables de bloquear algunos factores de virulencia de K. pneumoniae RYC 492. Estos resultados demuestran la factibilidad del uso de la ameba social D. discoideum para la búsqueda de moléculas de anti-virulencia que no posean efectos citotóxicos y el potencial de la planta H. aromaticum en la búsqueda de nuevos compuestos con actividad antimicrobiana.

Antibiotic resistance toward antibiotics is an increasingly relevant problem in public health due to the emergence of multidrug-resistant bacterial strains, the late development of new effective antimicrobials and the increased resistance of hypervirulent phenotypes. Among these, the Gram-negative bacillus Klebsiella pneumoniae has been emerged as a threat to global health, mainly due to the emergence and spreading of multiresistant and hypervirulent strains. The objective of this study is the implementation of a platform to evaluate the cytotoxicity of natural extracts and for the screening of potential molecules with antivirulence activity. The selection of the extracts must meet the following criteria: 1) Innocuous in cytotoxic assays in the biological model (Dyctiostelium discoideum) 2) Do not kill the bacterial pathogen K. pneumoniae RYC 492. 3) Affect the production of pathogen virulence factors causing no damage the host development. All dichloromethane extracts of the Helenium aromaticum plant (flower, stemleaf, and root) show cytotoxicity toward the social amoeba, delaying their social development compared to the methanolic extracts that were harmless to the amoeba allowing reach the culmination phase with the formation of fruiting bodies. In the antimicrobial evaluation of dichloromethane and methanol extracts did not show inhibition halos against the pathogenic strain K. pneumoniae RYC 492, thus fulfilling one of the proposed criteria that the extract show no antibiotic activity. In summary, only methanolic root extract of the H. aromaticum species met the 3 criteria: innoccous in cytotoxic assays, no antibiotic activity and exhibit antivirulence activity. From the methanolic root extract, 24 chemical compounds were detected and identified by UHPLC-ESI-MS / MS (12 flavonoids, 3 hydroxycinnamic acids, 1 phenolic acid, and 2 organic acids), which may be responsible for blocking some virulence factors of K. pneumoniae RYC 492. These results demonstrate the feasibility of the use of the social amoeba D. discoideum for the search of anti-virulence molecules that do not possess cytotoxic effects and the potential of the H. aromaticum plant in the search for new compounds with antimicrobial activity.