Caracterización de la actividad de PAL y su efecto sobre el contenido de flavonoides y fenoles de pared en cebada infestada por áfidos

Abstract

La infestación de la cebada por áfidos, produce graves alteraciones fisiológicas que resultan en una significativa pérdida de productividad de los cultivos. Frente a este daño, las plantas generan respuestas defensivas. El ataque de las plantas por insectos y patógenos conduce al aumento de actividad de la enzima fenil alanina amonio liasa (PAL) y la síntesis de compuestos fenólicos solubles altamente tóxicos, así como la síntesis de fenoles de la pared celular y de lignina. En la interacción planta-áfido no se ha caracterizado completamente éste tipo de respuesta defensiva. En esta tesis se ha postulado que bajo infestación por áfidos aumentaría la actividad de PAL, lo que resultaría en un aumento del contenido de flavonoides, fenoles de pared y lignina. Estos cambios en la vía fenil propanoide serían una respuesta defensiva de las plantas ante los áfídos. Así se esperaría encontrar una correlación entre los cambios de actividad de PAL, y el contenido de flavonoides, fenoles de pared y lignina, bajo condiciones de infestación. Por el contrario, el aumento de la actividad PAL, contenido flavonoides, fenoles de pared y lignina debieran presentar un correlación negativa con el grado de susceptibilidad de los cultivares a los áfidos. Para probar estas hipótesis se decidió caracterizar la actividad PAL inducida bajo infestación y medir simultáneamente los cambios en el contenido de flavonoides, fenoles de pared y lignina. Estos parámetros fueron medidos en el tiempo de infestación y con diferentes densidades de áfidos. Se utilizaron tres cultivares de cebada, Frontera, Acuario y Libra, los cuales previamente han sido evaluados en su susceptibilidad al áfido Schizaphis graminum R., siendo Frontera el cultivar menos susceptible, seguido de Libra y Acuario. La actividad PAL aumentó significativamente con la infestación, presentando una cinética bimodal. El cultivar Frontera presentó el mayor aumento de actividad PAL con un primer pico de actividad alrededor de las 36 h. Esto significó un aumento de casi cuatro veces comparado con la actividad presente en las plantas sanas. EL segundo pico de actividad PAL, fue bastante similar en magnitud entre los cultivares. El aumento de actividad PAL a las 36 h, en el cultivar Libra no se correlacionó con su nivel de susceptibilidad intermedia, presentando un menor aumento de actividad PAL que el cultivar Acuario, el más susceptible, solo 1,5 veces respecto al control sano. Dado que el cultivar Frontera presentó el mayor aumento de actividad PAL, éste fue utilizado para caracterizar algunos aspectos del efecto de los áfidos en la actividad de la enzima. Se encontró que existe una correlación positiva entre el nivel de actividad PAL y la densidad de infestación. También, se encontró que en plantas infestadas y mantenidas con un fotoperiódo de luz contínua, ocurrió un mayor aumento de la actividad PAL comparado con la actividad PAL medida en plantas sanas e infestadas bajo un ciclo fotoperiódico normal (luz/oscuridad, 14:10). Existió un efecto aditivo de la extensión del fotoperíodo en el aumento de la actividad PAL producida por el áfido. Cuando se analizó el efecto de la edad de las plantas en la actividad PAL bajo infestación, se encontró que ocurre una disminución importante en la actividad basal con la edad, pero que esta disminución no incide en el aumento de actividad PAL causado por los áfidos. Sin embargo, plantas de 10 y 16 días presentaron una mayor respuesta de actividad provocada por el insecto. Al analizar el contenido de flavonoides, se encontró sólo un compuesto mayoritario, tanto en plantas sanas como infestadas, saponarina una C-glicosil flavona. El contenido de saponarina aumentó con la infestación, siendo su acumulación posterior al incremento de actividad PAL (60 h). El cv. Libra presentó el mayor contenido de saponarina (105 mmoles g¹ p.s.), 3 veces el contenido observado en el cultivar Frontera (menos susceptible). Cuando se analizó el porcentaje de aumento del flavonoide respecto al control, el cv. Frontera presentó el mayor porcentaje de acumulación (35,2% a las 60 h de infestación), seguido de Libra (21,5%) y Acuario (24,1%). El cultivar Libra mostró además, un retraso de 48 h en el aumento de saponarina con respecto a los cultivares Frontera y Acuario, bajo infestación. En los experimentos de densidad de infestación, la acumulación del flavonoide se correlacionó positivamente con la densidad inicial de los áfidos. En los ensayos de dietas artificiales, la saponarina mostró ser tóxica para los áfidos. La sobrevivencia se redujo en un 50% al alimentar los áfidos con 3mM de saponarina por 24 h. Estas evidencias sugieren que la saponarina podría participar dentro de la estrategia defensiva de la cebada ante los áfidos. El contenido total de fenoles esterificados de pared aumentó con la infestación y este aumento fue posterior al aumento de la actividad PAL. El cultivar Frontera presentó la mayor acumulación de fenoles de pared (alrededor de un 40%, a las 60 h de infestación), mientras que los cultivares Libra y Acuario alcanzaron un 23 у 20%, respectivamente. Al estudiar el efecto de la densidad de infestación sobre el contenido de fenoles de pared, se encontró que éstos aumentan como resultado de un mayor densidad de áfidos. También, se estudió el efecto de los áfidos sobre el contenido de lignina. El nivel basal de lignina en el cultivar. Frontera fue el doble del contenido presente en el cultivar Libra y un 25% mayor que en Acuario. Se observaron dos fases de acumulación de lignina, ambas posteriores al aumento de actividad PAL por los áfidos. En la primera fase de acumulación (desde las 60 a 132 h de infestación), el cultivar Frontera presentó sólo 7% de aumento de lignina, mientras que en el cultivar Acuario fue del 12%. En este experimento el cultivar Libra presentó un retraso de 48h en la acumulación de lignina. La segunda fase de aumento de lignina, ocurrió al final del experimento y se correlacionó negativamente con la susceptibilidad de los cultivares. Además, el contenido de lignina se incrementó en función directa al nivel de infestación. En síntesis, bajo condiciones de infestación ocurre un aumento de actividad PAL que se correlacionó en parte con el nivel de susceptibilidad de los cultivares de cebada y cuyo aumento resulta en un mayor contenido de flavonoides, fenoles esterificados de pared celular y lignina. En todos los casos, el aumento de los compuestos señalados fue posterior al aumento de actividad PAL y dependiente del nivel de infestación. Estas evidencias, sugieren que la acumulación de los fenoles de pared, lignina y el flavonoide saponarina, podrían ser importantes en la resistencia a los áfidos.

Infestation of barley by aphids causes serious physiological alterations, resulting in a significant loss of productivity in crops. In response to this attack, the plants generate defense mechanisms. The attack of plants by insects and pathogens causes an increase in the activity of the enzyme phenyl alanine ammonia liase (PAL) and the synthesis of toxic phenolic compounds and the addition of phenols to the cell wall, and of lignin. This type of defensive response in the plant-aphid interaction has not been yet characterized. This thesis postulates that under aphid infestation the PAL activity would increase, and this would result in an increase of the flavonoids, wall phenols and lignin content. These changes in the phenyl propanoid circuit would be a defensive response of the plants faced with aphids. Then, a correlation would be expected between the changes of PAL activity and the content of flavonoids, wall phenols and lignin, under infestation conditions. On the other hand, the increase in PAL activity and of flavonoids, wall phenols and lignin contents should evidence a negative correlation with the degree of susceptibility of cultivars to aphids. To test this hypothesis it was decided to characterize the PAL activity induced under infestation, and to measure simultaneously the changes in flavonoids, wall phenols and lignin contents. These parameters were measured during the infestation period, with different aphid densities. Three barley cultivars were used, Frontera, Acuario and Libra, which had previously been tested for susceptibility to the aphid Schizaphis graminum R.. Frontera is the least susceptible cultivar, followed by Libra and Acuario. PAL activity increases significantly with infest, showing bimodal kinetics. The Frontera cultivar showed the largest increase in PAL activity, with the first PAL activity peak at around 36 h. This peack represented an increase of nearly four times the activity present in healthy plants. The second PAL activity peak was similar in magnitude for all cultivars. The increase of PAL activity at 36 h in the Libra cultivar was not in accordance with its level of intermediate susceptibility, showing a lower increase in PAL activity than the cultivar Acuario the most susceptible (only 1,5 times as compared with the healthy cultivar control). Since cv. Frontera showed the greatest increase in PAL activity, it was used to characterize some aspects of the effect of aphids on the activity of the enzyme. There was a positive correlation between the PAL activity level, and the infestation density. It was also found that in infested plants, kept under continuous light photoperiod, there was a higher increase in PAL activity compared with healthy plants and infested plants kept under a normal photoperiod cycle (light/darkness, 14:10). This result shows that there was an additive effect of the extension of the photoperiod on PAL activity induced by aphids. When analyzing the effect of age on the capacity of PAL induction under infestation it was found that there was an important decrease in basal activity with age, but that this decrease did not affect directly the PAL increase capacity. However, 10 to 16 days old plants showed a greater response of activity by aphids. When analyzing the flavonoids contents, only one major component was found, in both healthy and infested plants: saponarin, a C-glycosil flavone. The saponarin content increased significantly as a result of infestation. Its accumulation occurred after the increase in PAL activity (60 h). The cv. Libra showed the largest saponarin content (105 mmoles/g p.s.), three times that observed in the Frontera cultivar (less susceptible). When analyzing the percentages of increase of the flavonoid as compared with the control, the cv. Frontera showed the largest accumulation percentage (35,2% at 60 h from infestation), followed by Libra (21,5%) and Acuario (24,1%). The cv. Libra showed also a delay of 48 h in the increase of saponarin under infestation, as compared with Frontera and Acuario. In the infestation density experiments the accumulation of flavonoid correlated positively with the initial density of aphids. In artificial diet experiments, saponarin showed a toxicity to the insect. The survival was reduced by 50% by 3mM of saponarin after 24 h. This evidence suggests that saponarin could participate in the defense strategy of barley against aphids. The total content of sterified wall phenols increased under infestation, and this increase occurred later than that of PAL activity. The Frontera cultivar showed the largest accumulation of wall phenols (around 40% at 60 h after infestation), while Libra and Acuario reached 23 and 20% respectively. When studying the effect of infestation density on wall phenols content, it was found that these increase as a result of a greater aphid density. The effect ofthe aphids on lignin content was also studied. We found that the basal level of lignin in the Frontera cv. was twice that of the content in Libra, and 25% higher than in Acuario. Two phases of lignin accumulation were observed, both occurring after the increase in PAL activity caused by the aphids. In the first accumulation phase (from 60 to 132 h after infestation), Frontera showed a lignin increase of only 7%, while that of Acuario was 12%. In this experiment, the Librа showed again a delay of 48 h in accumulation, of lignin. The second lignin increase phase occurred at the end of the experiment, and the density of infestation was related to the susceptibility of the cultivars. Lignin content, also increased as a direct function of infestation level of the plants. In synthesis, under infestation conditions there was an increase ofthe PAL activity which correlates partly with the susceptibility level of the barley cultivars. This increment results in an increase in flavonoids, cell wall sterified phenols and lignin. In all cases, the increase in these compounds occurred after the increase PAL activity under infestation, and depended on the infestation level. This evidence suggests that the accumulation of wall phenols, lignin and the flavonoid saponarin could be involved in the resistance of barley to aphids.