Diseño de una estrategia de marcaje genético de células individuales en pez cebra

Abstract

El seguimiento de células individuales en un organismo multicelular ha sido difícil hasta ahora por la carencia de las herramientas apropiadas. En el sistema inmune, no ha sido posible hasta ahora examinar a nivel individual el destino de células como los neutrófilos que participan en los procesos inflamatorios y de resolución de la inflamación. Una forma de enfrentar este problema es mediante el marcaje genético y permanente de las células de interés para poder distinguirlas durante y después de los eventos en que participan. Como primer paso en esta dirección, en esta tesis se estableció en pez cebra el sistema de recombinación Cre/LoxP y el cassette de proteínas fluorescentes llamado Brainbow para marcar células con combinaciones únicas de colores para cada célula in vivo. Se generaron numerosos vectores con estos elementos en diferentes configuraciones y promotores y se probaron de manera transitoria inyectándolos en embriones de pez cebra. Finalmente, se logró generar diversas líneas transgénicas en las que se evaluó la capacidad de obtener células marcadas por recombinación. La combinación de dos de estas líneas transgénicas produjo la expresión de las distintas proteínas fluorescentes en embriones y larvas, demostrando que es una potente herramienta para el seguimiento in vivo de células individuales inequívocamente de forma controlada en el tiempo. En estos peces, se identificaron diversos tipos celulares marcados incluyendo epidermis, neuronas, pigmentos, músculos y células de la sangre.

Tracking individual cells in a multicellular organism has been difficult so far by the lack of appropriate tools. In the immune system, it has not been possible until now to examine the fate of individual cells such as neutrophils involved in inflammation and its resolution. One way to address this problem is through the genetic and permanent label of the cells of interest in order to distinguish them during and after the events in which they participate. As a first step in this direction, in this thesis the recombination system Cre /LoxP and the Brainbow strategy were established in zebrafish to label cells with unique color combinations for each cell in vivo. Numerous constructs were generated with these elements in different configurations and promoters and tested transiently by injecting them into zebrafish embryos. Finally, we were able to generate several transgenic lines in which the ability to obtain labeled cells was assessed through recombination assays. The combination of two of these transgenic lines produced the expression of different fluorescent proteins in embryos and larvae, showing that it is a powerful tool for the in vivo monitoring of individual cells in a controlled manner unequivocally in time. In such fish, various cell types including epidermis, neurons, pigments, muscles and blood cells were identified.