Caracterización inmunoquímica de hexoquinasas A de mamíferos

Abstract

Se describe la preparación y caracterización de un suero anti-hexoquinasa A de cerebro de rata y su uso para estudiar las relaciones estructurales de las hexoquinasas de varias especies de mamíferos. Se purificó hexoquinasa A hasta homogeneidad a partir de mitocondrias de cerebro de rata. El procedimiento de purificación consistía esencialmente en la separación de las mitocondrias por centrifugación diferencial, solubilización específica de la hexoquinasa por incubación de las mitocondrias con glucosa-6-P y cromatografía en DEAE-celulosa de la fracción solubilizada. La preparación final tenía una actividad específica de aproximadamente 57 unidades/mg de proteína. En geles de poliacrilamida presentaba una sola banda de proteína que coincidía con la banda de actividad. La enzima purificada se inyectó en conejos para producir un suero inmune. 1 ml de este suero era capaz de inmunoprecipitar 34 unidades de la hexoquinasa A usada como antígeno. Mediante inmunodifusión e inmunoelectroforesis en placas de agarosa se observó la presencia de una banda de precipitación única al reaccionar el suero con las preparaciones homogéneas o con extractos crudos de la enzima homóloga. La banda observada en placas de inmunodifusión presentaba actividad enzimática. El suero inmune era capaz de disminuir la actividad de la hexoquinasa A de cerebro o de hígado de rata. Sin embargo, la actividad de las hexoquinasas B, Co D de hígado no era afectada por el suero en condiciones experimentales iguales a las que producían disminución de la actividad de hexoquinasa A. Al enfrentar suero inmune y hexoquinasa A de hígado o cerebro, en placas de inmunodifusión, se observó una banda de precipitación continua al depositar ambas enzimas en pocillos adyacentes. La continuidad de las bandas indica que las dos proteínas son inmunológicamente indistinguibles. Sin embargo no se observaron líneas de precipitación al usar hexoquinasas B, CoDsemipurificadas de hígado de rata. Todavía más, el suero inmune ligado a Sepharose fue capaz de retener cuantitativamente la actividad de hexoquinasa A de cerebro o hígado, pero no la de las hexoquinasas B, C o D de hígado. En condiciones en que el suero inmune disminuia la actividad de hexoquinasa A de rata en ~95%, la actividad de la enzima aislada de algunos mamíferos fue solo parcialmente afectada: ratón (Mus musculus): 30%; hamster (Mesocricetus auratus), ratoncito oliváceo (Akodon olivaceus), ratoncito orejudo (Phyllotis darwini), cuy (Cavia porcellus) y degu (Octodon degus): ~40%; conejo (Oryctolagus cuniculus): 60%; oveja (Ovis aries): 10%; vaca (Bos taurus): 5%. Las hexoquinasas A de ratón, hamster, degu y conejo fueron retenidas casi totalmente (93 a 98%) en una columna de antisuero ligado a Sepharose. La enzima de bóvido fue solo parcialmente retenida. En experimentos de doble inmunodifusión con enzimas de varias especies, se observaron bandas de precipitación de identidad parcial con espolones de longitud variable. El análisis de la reacción inmunológica usando el suero inmune y hexoquinasa A de varios mamíferos mediante la microfijación de complemento permitió una mayor discriminación de las diferencias estructurales existentes entre esas hexoquinasas. Las distancias inmunológicas aparentes observadas mostraron las relaciones esperadas para esas especies. Se concluye que la ausencia de reacción inmunológica cruzada entre hexoquinasa A y las hexoquinasas B, C o D se debe а sustituciones de aminoácidos superficiales en la molécula de hexoquinasa A. La velocidad de tales sustituciones parece ser mayor en hexoquinasa A que en las otras hexoquinasas.

The preparation and characterization of an immune serum anti-hexokinase A from rat brain, and its utilization for the study of the structural relationships of the hexokinases of several mammals, are described. Hexokinase A was purified to homogeneity from rat brain mitochondria. The purification protocol consists of the separation of mitochondria by differential centrifugation, specific solubilization of hexokinase by glucose-6-P, and DEAE-cellulose chromatography of the solubilized fraction. The final preparation had a specific activity of about 57 units/mg of protein and, in polyacrylamide gels, showed one protein band coincident with a band showing enzyme activity. The purified enzyme was injected in rabbits to elicit an immune serum. One ml of the serum could immunoprecipitate 34 units of hexokinase A used as antigen. Immunodiffusion and immunoelectrophoresis revealed a single precipitation line when either the pure enzyme or crude extracts were tested. Precipitin lines, in immunodiffusion plates, were enzymically active. Enzyme activity of hexokinase A from either rat brain or liver was decreased by the serum. On the other hand, the activity of liver hexokinases B, C or D was not affected when tested in conditions identical to those in which inhibition of hexokinase A could be demonstrated. Immunodiffusion using liver hexokinase A revealed a precipitin band which fused with the band produced by brain hexokinase A in an adjacent well, indicating that both proteins are immunologically indistinguishable. No precipitin bands were observed when liver hexokinases B, C or D were tested. Furthermore, brain or liver hexokinase A activity was quantitatively bound by an immune serum-Sepharose matrix whereas the activities of liver hexokinases B, C or D was not bound. Under conditions in which the immune serum decreased 95% of the activity of rat hexokinase A, the activities of hexokinases A from some mammals were only partially inhibited: mouse (Mus musculus): 30%; hamster (Mesocricetus auratus), field-mouse (Akodon olivaceus), leaf-eared mouse (Phyllotis darwini), guinea-pig (Cavia porcellus) and degu (Octodon degus): 40%; rabbit (Oryctolagus cuniculus): 60%; sheep (Ovis aries): 10%, and cow (Bos taurus): 5%. Hexokinases A from mouse, hamster, degu and rabbit were almost completely retained (93 to 98%) by a column of antibody bound to Sepharose. The bovine enzyme was partially retained. Immunodiffusion analyses using the enzymes from several mammals revealed precipitin lines of partial cross-reactivity with spurs of variable length. A better immunological discrimination of the structural differences between the hexokinases A from several mammals was accomplished through complement microfixation studies. Observed apparent immunological distances showed the expected relationships for the species studied. It is suggested that the absence of immunological cross-reaction between hexokinase A and hexokinases B, Cor D is due to amino acid substitutions on the surface of the hexokinase A molecule. The rate of such substitutions seems to be higher in hexokinase A than in the other hexokinases.