Localización de dos mutaciones termosensibles en replicación del bacteriófago PM2 en el mapa físico viral

Abstract

El genoma del bacteriofago PM2 està constituido de una molécula de DNA circular, doble hebra, sobreenrollada de 10,2 КЫ que se postula replica por el modelo de circulo rotatorio, descrito en otros sistemas tales como fagos de DNA simple hebra ØX 174, fd, M13 y también en plásmidos de DNA doble hebra como pT181. En PM2 el sistema de replicación no es bien conocido y por las características de su genoma constituye un buen sistema para estudiar la replicación del DNA basadas en el modelo propuesto.

En los diferentes sistemas mencionados que replican bajo este modelo se ha demostrado que participa una endonucleasa especifica para el sitio ori, la que está codificada en un segmento de DNA sobrepuesto al sitio de origen de replicación o muy cercano а este. En PM2 el sitio ori ha sido ubicado en el fragmento Hind III-4 del mapa físico viral.

Como una manera de caracterizar el sistema de replicación de PM2 nos propusimos determinar la ubicación del gen de replicación mediante la localización en el mapa físico viral de dos mutaciones termosensibles en replicación del DNA. Para tal efecto, mediante técnicas de DNA recombinante, se construyeron genomas virales híbridos entre segmentos PstI-AvaI de DNA de PM2 silvestre y mutante y después de transfeccion de la bacteria huésped A. espejiana BAL31, se encontró que la progenie viral era defectiva en replicacion de DNA viral cuando los genomas infectantes estaban constituidos por los fragmentos PstI-Aval de 7,5 Kb ts y 2,5 Kb silvestre. Se verificó que la funcion de sintesis de DNA viral estaba alterada en la progenie obtenida post transfeccion. De ahi que nuestros resultados localizan el gen de replicación del bacteriðfago PM2 en el segmento de PstI-Aval de 7,5 Kb en el mapa fisico viral. Posteriormente se acoto la ubicación de dichas mutaciones, especificamente en qué porcion del fragmento PstI-AvaI de 7,5 Кь se encontraban. Para lograrlo se opto por construir genomas virales hibridos entre fragmentos Sau96I de 3,6 Kb y 6,9 Kb. Con los genomas virales hibridos Sau 961 se transfecto BAL31 y se encontro que el fenotipo ts en replicacion de DNA se presentaba cuando el genoma de la progenie viral había recibido el fragmento Sau 96I de 3,6 Kb ts. Los resultados obtenidos indican que las dos mutaciones termosensibles en replicacion del bacteriófago PM2 en el fragmento Sau 961 de 3,6 Kb, distante del origen de replicación viral.

The genome of the bacteriophage PM2 is a closed doublestranded supercoiled DNA molecule with a molecular weight of six million. It replicates by the rolling circular model, previously described for other systems such as ØX174, fd, M13 and doublestranded DNA plasmid such as pT181. The PM2 replication system is little known, and due to the genome characteristics it is a good system to study the replication of DNA. In the different systems that replicate following this model, a specific ori-site endonuclease participates that is codificated in a fragment next to the origin site or overlapping it. The ori-site in PM2 is located in the Hind III-4 fragment of the viral physical map. To characterize the PM2 replication system we decided to determine the position of the replication gene through the localization of two thermosensible mutations of DNA replication in the physical viral map. For this, we used DNA recombination techniques, and built hybrid viral genomes between PstI-AvaI fragments of wild type and mutant PM2 DNA. By transfection of the host bacterium A. espejiana BAL31. we found that the viral progeny was defective in DNA replication when the infectant genome was composed by PstI-Aval fragment of 7.5 Kb ts and 2.5 кь wt. Futhermore, we verified that the progeny obtained post transfection were defective in viral DNA synthesis. Therefore, our results localize the replication gene of bacteriophage PM2 in the PstI-AvaI fragment of 7.5 Kb. Then, we circumscribed the localization of the mutations, specifically defining in which portion of the PstI-Aval fragment they were found. Viral hybrid genomes were constructed between 3.6 Кb and 6.9 Kb Sau 961 fragments. When BAL31 cells were transfected with these viral hybrid genomes, it was found that the ts phenotype in DNA replication was present when the genome of viral progeny had the 3.6 Kb ts fragment. The results obtained indicate that the two ts mutations in DNA replication of bacteriophage PM2 are located in the 3.6 Кb Sau 961 fragment, far from of the viral replication origin.