Efecto paracrino de células troncales mesenquimáticas de la Gelatina de Wharton (WJ-MSC) en células endoteliales mediado por factores angiogénicos no-clásicos : rol de netrinas y su receptor neogenina-1

Abstract

La angiogénesis es el proceso en el cual se forman nuevos vasos sanguíneos a partir de otros preexistentes y es dependiente de la presencia de factores angiogénicos clásicos tales como VEGF, PDGF-A y Angiogenina. Muchos de estos factores tróficos son secretados por un tipo particular de células -las células troncales mesenquimáticas (MSCs)-por lo cual la terapia utilizando MSCs constituye una opción atractiva para el tratamiento de isquemia y la reparación tisular. Las Netrinas y las proteínas RGM fueron originalmente descritas como moléculas de guía axonal pero recientemente se ha planteado que participan en angiogénesis. Estas proteínas, actuando a través de sus receptores DCC, UNC5 o Neogenina-1, promueven o inhiben procesos angiogénicos dependiendo del contexto fisiológico en el cual se encuentren. La expresión de estos ligandos en MSC es aún desconocida por lo que en este estudio se evaluó la presencia de Netrina-1, Netrina-4 así como RGMa en células troncales mesenquimáticas de la gelatina de Wharton (WJ-MSC). Además, se determinó la presencia de estos ligandos en el medio condicionado por 48 horas de WJ-MSC. Se obtuvo que tanto Netrina-1 y 4 como RGMa son expresados por las células de Wharton. Netrina-1 está presente en el medio condicionado de las mismas. El hecho de que WJMSC produzcan moléculas de guía axonal como potenciales reguladores angiogénicos nos motivó a estudiar si las WJ-MSC tenían la capacidad de inducir angiogénesis en células endoteliales de la vena del cordón umbilical (HUVEC). Se determinó que el medio condicionado de WJ-MSC promueve tanto la migración como la formación de túbulos en células endoteliales de manera significativa. Más aún, demostramos que tanto Netrina-1 como RGMa por sí solos son capaces de inducir procesos angiogénicos en células endoteliales. Esto sugiere que el efecto paracrino de WJ-MSC se debe en parte a la presencia de estos factores, quedando por resolver aún en qué grado contribuyen a las diferentes etapas del proceso angiogénico. Finalmente nos interesó determinar la contribución de los receptores de Netrinas, en particular del receptor Neogenina-1, a la angiogénesis inducida por el medio condicionado de WJ-MSC y Netrina-1. Para ello, realizamos experimentos de pérdida de función utilizando células HUVEC establemente knock down para Neogenina-1. En células HUVEC, transducidas con shNeogenina-1, la capacidad de formar túbulos en respuesta al medio condicionado y a Netrina-1 aumentó con respecto a células control. Interesantemente, su capacidad migratoria no se vio afectada de manera significativa en respuesta a estos estímulos. Estos datos sugieren fuertemente que Neogenina-1 en su interacción con Netrina-1 tendría un efecto antiangiogénico, inhibiendo específicamente el proceso de formación de túbulos, lo que nos Ileva a sugerir que estos dos procesos, migración celular y formación de túbulos, estarían mediados por vías de señalización diferentes. Los efectos pro-angiogénicos de Netrina-1 en tanto estarían siendo mediados por otro receptor, aún no identificado, más afin por Netrinas que Neogenina-1. Concentraciones altas de Netrina-1 en tanto permitirían su unión a Neogenina-1 promoviendo un efecto opuesto al que genera la interacción Netrina-1/receptor desconocido y por ende disminuyendo el efecto angiogénico global de Netrina-1. Sin embargo, no podemos descartar una potencial función pro-angiogénica de Neogenina-1, dado que RGMa-cuyo único receptor conocido es Neogenina-1-sí induce procesos angiogénicos in vitro. Resumiendo, los resultados obtenidos en esta tesis demuestran que las WJ-MSC producen factores angiogénicos no-canónicos-Netrina-1 y RGMa- y que Neogenina-1 participa activamente en regular la angiogénesis inducida por éstos ligandos. Surge la necesidad de profundizar en los mecanismos de acción y en la búsqueda de otros potenciales receptores angiogénicos que se unan a Netrina-1. Sin duda estos resultados serán de mucha utilidad para desarrollar y/o optimizar estrategias terapéuticas tendientes a manipular procesos angiogénicos.

Angiogenesis, the process whereby new blood vessels are formed from preexisting ones, depends on the presence of classical angiogenic factors such as VEGF, PDGF-A and Angiogenin. Many of these trophic factors are secreted by a specific type of cells -mesenchymal stem cells ("MSCs")- making the therapy using MSCs an attractive option for the treatment of ischemia and tissular repair. Netrins and RGMs were originally described as axonal guidance molecules but recently have also been proposed to be involved in angiogenesis. These proteins, by acting through their receptors DCC, UNC5 or Neogenin-1, promote or inhibit angiogenesis depending on their physiological context. The expression of these ligands by MSC is still unknown so in this study we evaluated the presence of Netrin-1, Netrin-4 and RGMa in Wharton's Jelly Mesenchymal Stem Cells (WJ-MSC). We found that Wharton cells produce Netrin-1 and 4 as well as RGMa. Even more, Netrin-1 is present in the conditioned medium of these cells. The fact that WJ-MSC produce axonal guidance molecules as potential angiogenic regulators motivated us to study whether WJ-MSC had the ability to induce angiogenesis in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). We determined that the conditioned medium of WJ-MSC strongly promotes not only the migration but also the formation of tubules in endothelial cells. Moreover, we demonstrated that both Netrin-1 and RGMa have the capacity to induce angiogenic processes on endothelial cells. This suggests that the paracrine effect of WJ-MSC is in part due to the presence of these factors, leaving unresolved in which extent they contribute to the different stages of the angiogenic process. Finally, we were interested in the contribution of the Neogenin-1 receptor in the angiogenesis induced by the conditioned medium of WJ-MSC and Netrin-1. In order to accomplish this, we performed loss of function experiments using HUVEC cells stably knocked down for Neogenin-1. In HUVEC cells transduced with a shNeogenin-1, the ability to form tubules in response to the conditioned medium and to Netrin-1 was increased compared to the control. Interestingly, migratory ability of HUVEC was not affected significantly in response to these stimuli. These findings strongly suggest that the interaction of Neogenin-1 with Netrin-1 has an anti-angiogenic effect, inhibiting specifically the process of forming tubules but not the cellular migration of endothelial cells. This finding leads us to suggest that different signalling pathways would mediate these two processes, cellular migration and the formation of tubules. The pro-angiogenic effects of Netrin-1 would be controlled by a so far not identified receptor, most probably displaying a higher affinity for Netrin-1. High concentrations of Netrin-1 would allow its binding to Neogenin-1 resulting in an opposing effect and hence decreasing the global angiogenic effect of Netrin-1. However, given that RGMa- whose only known receptor1 is Neogenin- 1- induces angiogenic processes in vitro, Neogenin-1 also could potentially act as a pro-angiogenic mediator in its interaction with RGMa. Summarizing the results of this thesis, we conclude that WJ-MSC produce noncanonical angiogenic factors- Netrin-1 and RGMa- and that Neogenin-1 is actively involved in regulating angiogenesis induced by these ligands. The need for further studies of the action mechanisms and the search of new angiogenic receptor of Netrin-1 arises. Undoubtedly our results will be very useful to develop and/or optimize therapeutic strategies aimed for manipulating angiogenic processes.