Caracterización estructural y funcional del gen STP1 codificante de una S2P (SITE-2 Protease) involucrada en la vía de regulación SREBP de Xanthophyllomyces dendrorhous

Abstract

Xanthophyllomyces dendrorhous es una levadura que sintetiza astaxantina, carotenoide de interés biotecnológico por sus características antioxidantes y uso como colorante. En X. dendrorhous, se han identificado genes que formarían parte de la vía SREBP (Sterol Regulatory Element Binding Protein), la cual corresponde a una ruta conservada y caracterizada en mamíferos, y que está involucrada en la regulación de los niveles de esteroles celulares la cual responde a condiciones de bajos niveles de esteroles y de hipoxia. Entre los genes identificados se encuentran SRE1 y STP1 que codificarían a Sre1 y Stp1, homólogos de SREBP y de la Site-2 Protease (S2P) de H. sapiens de la vía SREBP, respectivamente, y probablemente estarían involucrados en la regulación de la carotenogénesis a través de los niveles de ergosterol (principal esterol en hongos). Por lo tanto, el objetivo de esta tesis fue identificar y caracterizar al gen STP1 que codificaría a la enzima Stp1 involucrada en la activación del producto génico de SRE1 (Sre1) que corresponde al activador transcripcional de la vía SREBP de X. dendrorhous. La secuencia génica de STP1 se identificó en bases de datos genómicas y transcriptómicas locales de X. dendrorhous; STP1 corresponde a un gen de 2.284 pb que codificaría un polipéptido Stp1 de 620 residuos que contiene los motivos conservados HE-(x)2-H у N-(x)2-P-(x)4-DG característicos en el sitio catalítico de las metaloproteasas de la familia M50. Para caracterizar funcionalmente al gen, se generaron cepas Astp1 desde: i) una cepa silvestre (CBS 6938), ii) una cepa que no produce ergosterol y que sobreproduce carotenoides (CBScyp61) y iii) una cepa que expresa la versión activa del factor transcripcional Sre1 (CBS.SRE1N). Para ello se construyó un módulo para la deleción de STP1, se transformó a la levadura y la deleción del gen se confirmó por PCR. Luego, se evaluó el fenotipo de color y crecimiento de las cepas parentales (CBS 6938, CBScyр61, CBS.SRE1N) y sus respectivos mutantes Astp1 en medio YM-agar suplementado con azoles o CoCl2; los azoles inhiben a enzimas citocromos P450 como aquellas involucradas en la síntesis de ergosterol y el CoCl2 induce una respuesta celular similar a la observada en condiciones de hipoxia. La producción de carotenoides y esteroles se analizó espectrofotométricamente, y se determinó su composición mediante RP-HPLC. Luego, se estudió la expresión de algunos genes que estarían regulados por la vía SREBP a nivel de sus mRNAs mediante RT-qPCR. Como resultados, la deleción de STP1 afectó el crecimiento de las cepas Astp1 derivadas de CBS 6938 y CBScyp61, en medios suplementados con azoles o CoCl2. También afectó la producción y composición de isoprenoides, particularmente en la cepа СBЅсур61 que no produce ergosterol y sobreproduce carotenoides. Los carotenoides y esteroles disminuyeron en un 40% у 18%, respectivamente; y la fracción de astaxantina se redujo a un 66% de un 78%. Esto se relaciona con una disminución significativa en los niveles de transcrito de los genes HMGR y HMGS de la ruta del MVA, de los genes carotenogénicos crtS y crtR que controlan los pasos de ẞ-caroteno a astaxantina, y CYP51, involucrado en la síntesis de esteroles. En conclusión, STP1 codificaría a una metaloproteasa y su deleción afecta el crecimiento en presencia de azoles o CoCl2, y la producción/composición de isoprenoides como esteroles y carotenoides, lo que sugiere que el gen STP1 identificado si estaría involucrado en la vía SREBP de X. dendrorhous.

Xanthophyllomyces dendrorhous is a yeast that synthesizes astaxanthin, а carotenoid of biotechnological interest due to its use as antioxidant and colorant. Genes that would be part of the SREBP (Sterol Regulatory Element Binding Protein) pathway in X. dendrorhous have been identified; this pathway is conserved and characterized in mammals, and is involved in the regulation of cellular sterol levels and responds to low levels of sterols and hypoxia conditions. In the yeast, the SRE1 and STP1 genes encoding Sre1 and Stp1, homologues of SREBP and Site-2 Protease (S2P) from H. sapiens were identified, respectively, and probably through the SREBP pathway the levels of ergosterol (major fungal sterol) would be involved in the regulation of carotenogénesis. Therefore, the aim of this thesis was to identify and characterize the STP1 gene that would encode the Stp1 enzyme involved in the activation of the SRE1 gene product (Sre1) corresponding to the transcriptional activator of the X. dendrorhous SREBP pathway. The STP1 gene sequence was identified in local genomic and transcriptomic databases of X. dendrorhous; STP1 corresponds to a 2,284 bp gene encoding a 620-residue Stp1 polypeptide containing the characteristic HE-(x)2-H and N- (x)2-P-(x)4-DG conserved motifs at the catalytic site of the M50 family metalloproteases. To functionally characterize the gene, Astp1 strains were generated from: i) a wild-type strain (CBS 6938), ii) a non-ergosterol producing strain that over-produces carotenoids (CBScyp61) and iii) a strain that expresses the active version of the Sre1 transcriptional factor (CBS.SRE1N). For this, a STP1 deletion module was constructed, introduced into the yeast and the generated deletion of the gene was confirmed by PCR. The color and growth phenotype of the parent strains (CBS 6938, CBScyp61, CBS.SRE1N) and their corresponding Astp1 mutants was evaluated in YM-agar medium supplemented with azole or CoCl2; the first agent affects cytochrome P450 enzymes and the second one induces a cellular response similar to that observed under hypoxia conditions. The production of carotenoids and sterols was analyzed spectrophotometrically, and their composition was determined by RP-HPLC. Then the expression of some genes that would be regulated by the SREBP pathway was studied at their mRNAs level by RT-qPCR. As results, the STP1 deletion affected the growth of Astp1 strains derived from CBS 6938 and CBScyp61 in media supplemented with azoles or CoC2. Production and composition of isoprenoids were also affected, particularly in the mutant derived from strain CBScyp61 that does not produce ergosterol and overproduces carotenoids. In this case, carotenoids and sterols decreased 40% and 18%, respectively, and the astaxanthin fraction was reduced to 66% from a 78%. These results could be related to a significant decrease in transcript levels of the HMGR and HMGS genes of MVA pathway, crtS and crtR carotenogenic genes that control the steps from ẞ-carotene to astaxanthin, and CYP51 gene involved in the synthesis of sterols, that was observed. In conclusion, the identified STP1 gene would encode a metalloprotease and its deletion affects growth in the presence of azoles or CoCl2, and the production/composition of isoprenoids such as sterols and carotenoids, suggesting that STP1 would be indeed involved in the SREBP pathway of X. dendrorhous.