Estudios de las características estructurales y energéticas de los sitios de unión de nad y nadp mediante potenciales estadísticos

Abstract

El reconocimiento molecular de los dinucleótidos de nicotinamida adenina, NAD y NADP es una característica fundamental de un número importante de enzimas que participan en procesos del metabolismo redox y señalización intracelular. En la actualidad, la gran cantidad de estructuras cristalográficas determinadas con estas coenzimas permite la posibilidad de desarrollar potenciales estadísticos para estudiar las características estructurales y energéticas de los sitios de unión de NAD y NADP en proteínas. En este trabajo, usamos los potenciales estadísticos para transformar las frecuencias observadas de interacciones entre átomos de la coenzima y la proteína, en magnitudes relacionadas con energía, denominadas pseudo-energías. Se analizaron las interacciones más frecuentes y sus perfiles de pseudo-energía en una base de datos de 359 estructuras en el caso de NAD y 330 en el caso de NADP. Una característica distintiva en los complejos con NAD es la presencia de un carboxilato de aspartato o glutamato en la proteína que forma un puente de hidrógeno con la ribosa adyacente a la adenina. En los complejos con NADP una cadena lateral de una arginina forma al mismo tiempo una interacción electrostática con el fosfato-2' y una interacción catión-n con la adenina. Para ambas coenzimas, grupos hidroxilo en la proteína forman puentes de hidrógeno con los grupos fosfato, mientras que el bolsillo alrededor de la nicotinamida muestra frecuentemente una cadena lateral aromática y además un puente de hidrógeno entre el nitrógeno en su grupo amida y el oxigeno en las cadenas principales de los residuos. Adicionalmente, utilizamos un grupo de enzimas con estructura y constantes de disociación conocida con el objetivo de optimizar los potenciales estadísticos para obtener una mejor correlación entre las pseudo-energías calculadas y la información experimental. Las pseudo-energías calculadas a partir de estos potenciales estadísticos optimizados se correlacionan con los cambios en la energía libre de unión en mutantes por alanina y otros residuos utilizando tanto estructuras cristalográficas como modelos in silico. Finalmente, utilizamos los potenciales estadísticos para proponer una mutación para cambiar la preferencia por coenzima en la enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa de Leuconostoc mesenteroides. Resultados in vitro, al medir las velocidades iniciales a diferentes concentración de NAD o NADP, demuestran que la mutante Ala45Asp cambia la preferencia de esta enzima desde NADP a NAD.

The molecular recognition of the nicotinamide adenine dinucleotides, NAD and NADP is a fundamental characteristic in a large number of enzymes involved in redox metabolism processes and intracellular signaling. Nowadays, the high amount of crystallographic structures with these coenzymes allow the possibility to develop statistical potentials to study the structural characteristics and energetics of the NAD and NADP binding sites in proteins. In this work, we use statistical potentials to transform the observed interactions frequencies between atoms in the coenzyme and the protein, in magnitudes related with energies, called pseudo-energies. We analyze the most frequent interactions and their pseudo-energies profiles in a database of 359 structures in the case of NAD and 330 in the case of NADP. One distinctive characteristic in the NAD complexes is the presence of a carboxylate from aspartate or glutamate in the protein establishing a hydrogen bond with the ribose adjacent to the adenine. In the NADP complexes an arginine side chain forms, at the same time, an electrostatic interaction with the 2'-phosphate and a cation-n with the adenine. For both coenzymes, hydroxyl groups in the protein form an hydrogen bonds with the phosphate groups, meanwhile the pocket around the nicotinamide often shows an aromatic side chain and also a hydrogen bond between its amide nitrogen and the main chain oxygen in the residues. Additionally, we use a group of enzymes with structure and known dissociation constant with the objective to optimize the statistical potentials to obtain a better correlation between the pseudo-energies calculated and the experimental data. The pseudoenergies calculated from this optimized statistical potentials correlates with the binding free energy changes in alanine and other residues mutants using crystallographic structures and in silico models. Finally, we use the statistical potentials to propose a mutation to change the coenzyme preference of the enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase from Leuconostoc mesenteroides. In vitro results based on the quantification of the initial velocities of the enzyme at different NAD or NADP concentrations demonstrate that the mutant Ala45Asp change the preference of this enzyme from NADP to NAD.