La agregación espontánea de la mutante Q8H de la microcina E492 anula la actividad bactericida y aumenta el efecto citotóxico en células tumorales

Abstract

La microcina E492 es una bacteriocina producida por Klebsiella pneumoniae RYC492 y activa sobre cepas de Enterobatericeae. Su mecanismo de acción requiere del reconocimiento en la membrana externa de la célula sensible por los receptores de catecoles FepA, Fiu y Cir, y de la proteína TonB para ejercer su acción tóxica en la membrana citoplasmática de la bacteria sensible. Mediante el estudio de mutaciones puntuales de la microcina E492 se identificaron aminoácidos que son necesarios para la actividad antibacteriana. Así, dos mutantes (PL-G18S y PL-G18D) en el péptido líder no exportan la microcina al medio extracelular. Por otro lado la mutante PL-V5V permitió determinar que el predicho aminoácido 5 es el aminoácido en el cual se inicia la traducción de la microcina E492. La mutante Q8H es la única que afecta a la microcina E492 madura (una vez procesado el péptido líder). Esta mutación impide la translocación a través de la membrana externa de la célula blanco, pero mantiene la capacidad de formar canales iónicos y de ser activa sobre esferoplastos de bacterias sensibles. La microcina E492 Q8H se encuentra principalmente en forma oligomérica y se agrega espontáneamente formando fibras amiloides, las cuales se detectaron mediante la unión de las fibras de microcina a colorantes específicos rojo Congo y tioflavina T. La formación de estas fibras amiloides explica porqué la microcina E492 no es capaz de atravesar la membrana exterha para ejercer sų açción. La microcina E492 disminuye la viabilidad de células tumorales (melanoma murino B16, adenocarcinoma colon-rectal murino MC38, carcinoma de colon humano HT29 у НСТ116) sin afectar a cultivos primarios (esplenocitos y cultivos de médula ósea) o líneas celulares no tumorales (N2A y macrófagos). Estos resultados permiten explorar una nueva aplicación de la microcina E492 como agente antitumoral. Se determinó que la microcina E492 Q8H posee actividad citotóxica sobre células de melanoma murino B16 y carcinoma de colon humano HT29, y que es más eficiente en disminuir la viabilidad de estas células, pues disminuye la viabilidad en un tiempo de incubación menor y a más bajas concentraciones que la microcina E492 silvestre. Finalmente se determinó que las fibras de microcina E492 silvestre disminuyen el tamaño de tumores de carcinoma de colon humano HT29 en un modelo in vivo de cáncer, el cual utiliza un ensayo "xenograft" en ratones "nude". Los resultados de estos experimentos muestran que se produce una disminución significativa del volumen y la masa de los tumores, incluso se observa remisión total en un 20% de los ratones tratados. Un efecto similar se obtiene cuando la microcina E492 es administrada por vía oral. No se observó ningún efecto tóxico en los ratones tratados con microcina E492, indicando que la microcina E492 es un buen candidato para ser usado como antitumoral.

Microcin E492 is a bacteriocin active on several strains of the Enterobactericeae family that it is produced by Klesbsiella pneumoniae RYC492. Its mechanism of action requires the recognition by the cathecolicate receptor FepA, Fiu and Cir of the outer membrane and the protein TonB to extert the toxic activity in the inner membrane of the sensitive cells. In this study, through point mutations on microcin E492, amino acids necessary for the antibacterial activity were identified. Thus, two mutants (PLG18S and PL-G18D) in the leader peptide do not export microcin to the extracellular space. On the other hand, the PL-V'5V mutant allowed the identification of the fifth amino acid as the start codon. The Q8H mutant affects mature microcin E492. This mutation interferes the translocation through the outer membrane, but maintains its capacity to form ionic channels and it is active over sensitive bacteria spheroplasts. Microcin E492 Q8H is fouup principally in an oligomeric form and aggregates spontaneously forming amyloid fibers, which were detected by the binding to specific colorants, such as Congo red and thioflavinT. The amyloid fiber formation would explain why this microcin mutant cannot pass through the outer membrane to exert its action. Microcin E492 diminished the tumoral cells viability (murine melanoma B16, murine colo-rectal adenocarcinoma MC38, human colon carcinoma HT29 and HCT116) without affecting primary cell cultures (splenocites and bone marrow cultures) or non tumoral cellutar lines (N2A and macrophages). This result allows to explore a new application of microcin E492 as an antitumoral agent. It was also determined that microcin E492 Q8H has cytotoxic activity over murine melanoma B16 cells and human colon carcinoma HT29, and that this mutant diminishes the cell viability at lower incubation times and lower concentrations than the wild type microcin. On the other hand, it was determined that the wild type microcin E492 fibers diminished the size of human colon carcinoma HT29 tumor in an in vivo "xenograft" cancer model in "nude" mice. After the treatment, a significant volume and tumor mass reduction was produced, and total remission in a 20% of the treated mice was observed. A similar effect was obtained when microcin E492 was orally administrated. No toxic effect was observed in mice treated with microcinE492 indicanting that this bacteriocin is a good candidate to use as an antitumoral agent.