Identificación y clasificación de aislados bacterianos del genero Vibrio obtenidos desde muestras ambientales del sur de Chile, a través de una genotipificación y secuenciación de sus genomas

Abstract

Las bacterias del género Vibrio son abundantes y diversas, habitando prácticamente todos los ecosistemas marinos. Se han descrito más de 120 especies, muchas de ellas patógenas para los humanos y otras para animales. Debido al impacto que pueden tener estas bacterias en la salud de la población y de los cultivos comerciales (mariscos, peces, entre otros), su estudio es de gran interés para las autoridades e investigadores. El objetivo de este trabajo es la identificación y clasificación de 17 aislados ambientales de bacterias del género Vibrio, a través de una genotipificación, secuenciación y posterior análisis bioinformático de sus genomas. Las bacterias fueron aisladas desde agua de mar y tejido blando de choritos (Mytilus chilensis) provenientes de las costas de Quillaipe (Puerto Montt, Chile). Luego de extraer el ADN genómico y amplificar el gen ARNr 16S, se utilizaron las endonucleasas Hha1, Hinf1 y Msp1 para digerir los productos amplificados del gen y, así, obtener un patrón de restricción característico con el cual se elaboró un dendrograma. El dendrograma resultante determinó seis grupos o ribotipos distintos entre los 17 aislados. Se secuenció el genoma de un representante de cada grupo, excepto por el grupo cuatro donde se secuenció el genoma de dos aislados debido a que provenían de distinto origen. El tamaño de los genomas obtenidos con el ensamble de las lecturas varía entre los 5 y 6,2 millones de pares de bases. Además, los ensambles presentan una calidad adecuada según los parámetros N50, N75, L50, L75. Esto sugiere que los ensambles son adecuados para los análisis posteriores. Se realizó un análisis de secuencias multilocus (MLSA, por su sigla en inglés) con los genes constitutivos ftsZ, gnd, gyrB, metG, pyrH, recA, rpoA y pyrC para determinar las relaciones taxonómicas y determinar la identidad de la especie de los aislados de vibrios secuenciados. El resultado del MLSA indica que los aislados M3AB11 y M3AB5 pertenecen a la especie Vibrio pacinii del clado pacinii, mientras que el aislado M3AB8 pertenece a la especie Vibrio cyclitrophicus del clado splendidus. Por su parte, los aislados M1AB29, P1B4 y M1AB15 pertenecen a las especies Vibrio alginolyticus, Vibrio jasicida y Vibrio diabolicus, respectivamente, las tres pertenecientes al clado harveyi. Se observó que el dendrograma elaborado presenta valores de bootstrap cercanos a 100, indicando gran robustez y fiabilidad de los nodos formados. El puntaje de fiabilidad para el MLSA realizado con el método de neighbor-joining es de 0,78. Como análisis secundario, se usó la herramienta SpeciesFinder y el método ANI para corroborar la identidad de las especies de vibrios. Si bien hubo discrepancia en la identificación de la especie del aislado M1AB15, esto pudo deberse a la gran similitud que hay entre especies del clado harveyi y a diferencias en los marcadores genómicos utilizados para comparar la similitud entre las especies. El valor orthoANI de los genomas de los aislados comparado con el de la especie determinada por el MLSA es superior a 95%, valor que se ha descrito como umbral para determinar una especie del género Vibrio mediante este método. Esto apoya la clasificación realizada por el análisis multi locus. Por último, la anotación de los genomas indica la presencia de genes asociados a diversas funciones, entre las que destacan división y ciclo celular, transporte celular, respuesta a estrés, metabolismo de diversas moléculas, entre otras funciones necesarias para la supervivencia. Además, el análisis determinó que los seis aislados secuenciados presentan genes asociados a factores de virulencia y genes de resistencia a compuestos antimicrobianos, además de la presencia de profagos. Es necesario realizar ensayos experimentales para determinar si el fenotipo de estos aislados expresa estas características y en qué condiciones lo hacen. Estos son los primeros casos de Vibrio pacinii y Vibrio jasicida provenientes de muestras ambientales que son reportados en Chile. El análisis realizado permitió identificar y clasificar distintas bacterias del género Vibrio revelando la presencia de nuevas especies potencialmente virulentas en el país.