Caracterización de elementos genéticos extracromosómicos en Xanthophyllomyces dendrorhous y su relación con la actividad micocida

Abstract

Xanthophyllomyces dendrorhous es una levadura basidiomicete pigmentada que ha sido aislada principalmente desde regiones frías de Japon y Rusia. En varias de sus cepas se ha descrito la existencia de Elementos genéticos extracromosómicos (EGEs) del tipo RNA de doble hebra (dsRNA) y plasmidios lineales de DNA de doble hebra. En hongos filamentosos y levaduras Generalmente estos elementos son crípticos en función y sólo en algunos casos han sido asociados con algún fenotipo en su hospedero como la actividad antifúngica. Recientemente, por primera vez se determinó la existencia de esta actividad en algunas cepa de la X. dendrorhous y se identificó una proteasa aspártica como posible micotoxina, sin embargo, las bases genéticas de este fenotipo aun son desconocidas. En trabajos previos, desde la cepa UCD 67-385, que posee 4 dsRNAs - L (5 kb), M (3,7 kb), S1 (0,9 kb) y S2 (0,6 kb) - se obtuvo una cepa 385(S2-40) que carecen de S2 dsRNA y que mantienen la actividad antifúngica, sugiriendo que este elemento no es el determinante genético del fenotipo. Considerando estos antecedentes, el objetivo de este trabajo fue caracterizar los EGEs de diferentes cepas de X. dendrorhous y analizar su posible relación con la actividad antifúngica observada. Inicialmente, se determinaron los perfiles de EGEs de distintas cepas de Х. dendrorhous optimizando un método de extracción y análisis de dsDNAs. En el perfil de dsRNAs, se encontró un polimorfismo en los dsRNAs presentes, el cual estaría relacionado con el origen geográfico donde fue aislada cada cepa. Estos resultados sugieren que los dsRNAs no son las bases genéticas responsables de la actividad antifúngica y su función en el hospedero aún es desconocida. Se analizó la estabilidad del perfil de dsRNAs en la cepa curada durante la curva de crecimiento debido ya que en otras levaduras se ha descrito la aparición de nuevos dsRNAs que provienen del procesamiento de los dsRNAs de mayor tamaño. La ausencia permanente de la molécula S2, sugiere que esta corresponde a un dsRNA satélite. Para analizar la funcionalidad de L, M y S1, se realizaron experimentos de curación sobre la сера 385(S2-40) utilizando distintos métodos que en otras levaduras han permitido la eliminación completa de los dsRNAs. A pesar de los efectos inhibitorios de los tratamientos aplicados sobre el crecimiento de la cepa, no se obtuvieron clones que carezcan de alguno o todos los dsRNAs. Continuando con la caracterización de EGEs, en los perfiles de dsDNAs obtenidos para las distintas cepas, se observó una alta variabilidad en el número (2 a 7) y tamaño (1,2 a 7,5 kb) de los dsDNAs. Fue posible clonar y secuenciar el plasmidio de menor tamaño de la cерa CBS 6938 de X. dendrorhous. En el análisis bioinformático de la secuencia nucleotídica y traducida, no se encontraron similitudes con la base de datos del NCBI Sólo se logró identificar regiones de repetidos invertidos en los extremos de la secuencia. Estas regiones fueron previamente descritas para otro plasmidio lineal de X. dendrorhous pDK1, y que participarían en la estabilidad de estas moléculas. Considerando que se identificó una proteasa aspártica como la potencial toxina, se diseñaron partidores específicos para el gen asp para las reacciones de PCR usando como molde el DNA genómico purificado de las distintas cepas de X. dendrorhous. Los resultados obtenidos sugieren que la actividad estaría codificada en el cromosoma celular. Todas las cepas de poseen EGEs del tipo dsDNAs y/o dsRNAs, los cuales forman perfiles altamente complejos. Esta alta variabilidad de EGEs intra-especie es interesante desde el punto de vista genético que hace a esta levadura un buen modelo para estudiar la diversidad de la información genética a nivel de los micovirus y plasmidios, fenómeno poco comprendido especialmente en levaduras basidiomicetes.

Xanthophyllomyces dendrorhous is a basidiomycetous pigmented yeast mainly isolated from cold regions of Japan and Russia. The existence of Extrachromosomal Genetics Elements (EGES), that can be double-stranded RNA (dsRNA) and linear plasmids of double-stranded DNA (dsDNA), have been reported in several strains of this yeast. Usually these genetic elements are cryptic in function in yeast and filamentous fungi, and only in few cases have been associated to a phenotype in the host such as the antifungal activity. Recently, we determined for first time that some strains of X. dendrorhous display this phenotype and aspartic protease was identified as a potential toxin, however the genetic bases are still unknown. In previous works with X. dendrorhous UCD 67-385, strain that has 4 dsRNAs - L1 (5 kb), L2 (3,7 kb), S1 (0,9 kb) y S2 (0,6 kb) - we obtained a strain lacking the S2 dsRNA 385(S2-40). This cured strain maintains the antifungal activity, suggesting that S2-dsRNA is not the genetic determinant of this phenotype. Considering these antecedents, the objective of this work was to characterize the EGEs in different strains of X. dendrorhous and P. rhodozyma, and to analyze their possible relationship to the observed antifungal activity. Initially, the EGEs profiles of numerous strains of X. dendrorhous and P. rhodozyma were determined and a method for the extraction and analysis of the dsDNA plasmids was optimized. In the profile of dsRNAs, we found a polymorphism in these molecules might be related to the geographical origin of each strain. From their comparison it was concluded that dsRNA is not responsible for the antifungal activity; therefore its possible function is still unknown. We analyzed the stability of the dsRNAs