Identificación de activadores inmunológicos de la vía asociada a la respuesta a proteínas mal plegadas 1alpha/XBP-1s en células dendríticas

Abstract

La respuesta a proteínas mal plegadas (Unfolded Protein Response, UPR) es una respuesta fisiológica esencial para la sobrevida de células eucariontes ya que su función consiste en aliviar el estrés causado por la acumulación de estas especies en el retículo endoplásmico (RE) o en su defecto, gatillar procesos de muerte celular. En el sistema inmune, se ha descrito que la respuesta a proteínas mal plegadas modula el desarrollo y función de diversos tipos celulares incluyendo las células dendríticas (DCs). De hecho, uno de los sensores de estrés de RE, IRE1a y uno de sus blancos, el factor de transcripción XBP-1s, se encuentran activos de manera constitutiva en DCs en donde controlan diversos procesos los que incluyen la expresión de integrinas, la homeostasis del RE y el proceso de presentación cruzada. Si bien lo anterior ha sido estudiado en DCs en ausencia de inflamación, aún se desconoce si la respuesta a proteínas mal plegadas modula la función de DCs durante condiciones inflamatorias tales como infección, alergia o cáncer. En este trabajo de tesis, establecimos como objetivo principal el elucidar si la detección de estímulos innatos derivados de alérgenos, bacterias o tumores eran capaces de activar la vía IRE1a/XBP-1s en DCs y por otra parte, nos propusimos definir la relevancia de este eje en la función de DCs activadas. Para estudiar este fenómeno, se generaron DCs de manera in vitro a partir de precursores de medula ósea de ratones C57BL/6 en presencia de la citoquina FLT3-L. Estos cultivos fueron estimulados con un compuesto derivado de pared celular de bacterias Gram negativas (lipopolisacárido, LPS), un alérgeno representativo del desarrollo de asma alérgico (extracto de ácaro de polvo) o con una preparación de lisados de células derivadas de melanoma metastásico, que ha sido utilizado eficientemente en una vacuna basada en DCs para pacientes con melanoma avanzado. Nuestros resultados indican que, de estos tres estímulos, los lisados celulares de melanoma son los compuestos más eficientes en inducir la activación de miembros de la respuesta a proteínas mal plegadas tales como XBP-1s, BiP у СНОР tanto a nivel de RNA mensajero (mRNA) como proteína. Por otro lado, también demostramos que la inhibición del dominio endoribonucleasa (RNAsa) de IRE1a en DCs, reduce su capacidad de secretar interleuquina 12 en respuesta a activación con lisados celulares de melanoma. Adicionalmente, la inhibición de la actividad RNAsa de esta enzima en DCs activadas con lisados celulares de melanoma tiende a reducir los niveles de expresión del marcador de activación temprana CD69 en linfocitos T CD8+ específicos para un antígeno modelo. En resumen, nuestros resultados demuestran que los lisados de líneas celulares de melanoma son potentes activadores del eje IRE1a/XBP-1s en DCs y que esta vía es importante para la producción de citoquinas y activación de linfocitos T CD8+ en respuesta a la activación con lisados de células cancerosas. Este trabajo constituye un aporte para comprender de mejor manera el rol de la respuesta a proteínas mal plegadas en la función de células dendríticas, especialmente en un contexto anti-tumoral.

The unfolded protein response (UPR) is an essential physiological response for the survival of eukaryotic cells, since its function is to alleviate the stress caused by the accumulation of protein folding intermediates in the endoplasmic reticulum (ER), or when it fails to do so, trigger cell death. In the immune system, it has been described that the UPR can modulate the development and function of different cell types including dendritic cells (DCs). In fact, one of the ER stress sensors, IRE1a and its target the transcription factor XBP-1s, are constitutively activated in DCs, where they control different processes that includes integrin expression, RE homeostasis and cross presentation of dead-cell associated antigens. While this process has been studied in DCs in the absence of inflammation, the role of the UPR remains unclear in inflammatory contexts such as infection, allergy, or cancer. In this thesis work we established as our main objective to elucidate whether the detection of innate stimuli derived allergens, bacteria, or tumors were capable of activating the IRE1a/XBP-1s pathway in DCs, and on the other hand, we propose to define the functional relevance of this axis in the function of activated DCs. In order to address these questions, DCs were generated in vitro from C57BL/6 mice bone marrow in the presence of the cytokine FLT3-L. These cultures were stimulated with a compound derived from the cell wall of Gram negative bacteria (Lipopolysaccharide, LPS), a common allergen involved in the development of allergic asthma (house dust mite extract) or with a cell lysate preparation derived from human metastatic melanoma lines that has been used efficiently in a DC-based vaccine for patients with advanced melanoma. Our results show that out of the stimuli tested, the melanoma cell lysates are the most efficient compounds at inducing the activation of specific UPR components, such as XBP-1s, BiP and CHOP, both at messenger RNA (mRNA) and at protein level. On the other hand, we also demonstrated that inhibition of the IRE1a endoribonuclease (RNAse) domain in DCs decreases the capacity of DCs to secrete interleukin 12 in response to activation with melanoma cell lysates. Furthermore, inhibition of the IRE1a RNAse domain in DCs activated with melanoma cell lysates show a tendency to decrease expression of the early activation marker CD69 in CD8+ T cells specific for a model antigen. In summary, our results show that melanoma cell lysates act as potent activators of the IRE1a/XBP-1s axis in DCs and that this pathway is relevant for the production of cytokines and T cell activation in response to activation with cancer cells. This work serves to better understand the role of the UPR in the functionality of DCs, particularly in an anti-tumoral context.