Papel del eje IRE1 de la UPR sobre el posicionamiento y función lisosomal en células dendríticas murinas

Abstract

La respuesta a proteínas mal plegadas (unfolded protein response, UPR) es un mecanismo altamente conservado que se activa cuando la homeostasis proteica del retículo endoplásmico (RE) se altera, como en casos de infección o desregulación metabólica, generando una acumulación de proteínas mal plegadas en el lumen del organelo. Esta respuesta es mediada por tres sensores ubicados en la membrana del RE entre los cuales se encuentra el sensor IRE1, el cual es altamente conservado y ha demostrado tener un rol no canónico en el sistema inmune. Este sensor contiene un dominio endoribonucleasa (RNasa) que cumple una función dual, ya que por una parte media el splicing no convencional del mRNA codificante para Xbp1, el cual se traduce en un potente factor de transcripción llamado “XBP1 spliced” o XBP1s y; por otra parte, el dominio RNasa de IRE1 puede degradar diversos mRNAs en un proceso llamado ‘RIDD’ (Regulated IRE1- Dependent Degradation). Entre los blancos de RIDD se han descrito mRNAs codificantes para proteínas relacionadas con biogénesis lisosomal, el cual es un proceso clave en la presentación cruzada de antígenos a linfocitos citotóxicos. Sin embargo, a pesar de esta evidencia, el papel de IRE1 en la funcionalidad y dinámica fago-lisosomal no se ha descrito en profundidad. En esta tesis de magister, y continuando con el trabajo presentado durante el seminario de título, se estudió la importancia del eje IRE1 en la maduración fagosomal y el posicionamiento lisosomal. Para ello, se utilizaron diversas técnicas de biología molecular y celular que permitieron el estudio de las características de los fagosomas tanto a nivel de célula completa, como a nivel de organelos individuales, permitiendo una aproximación multifocal al problema planteado. Se demostró, mediante 3 citometría de flujo, qPCR y microscopía de epifluorescencia, que la expresión de Lamp1 es directamente modulada por el eje IRE1 a través de RIDD. Además, nuestros resultados de PhagoFACS indican que en ausencia de IRE1 los fagosomas de DCs maduran de manera acelerada, ya que existe una mayor acumulación de proteína Lamp1 y una mayor degradación del antígeno OVA. Interesantemente, este fenómeno no se observa en el caso de células deficientes en XBP1, sugiriendo que la incapacidad para presentar de manera cruzada en células dendríticas XBP1 knock-out reportada en la literatura no se debería a un mal funcionamiento de los procesos de maduración fago-lisosomal.

The Unfolded Protein Response (UPR) is a highly conserved mechanism activated when the endoplasmic reticulum (ER) proteostasis is altered, as in cases of infection and metabolic disorders, which generates the accumulation of misfolded proteins in the lumen of the organelle. This response is mediated by three sensors, located in the ER membrane, among these sensors, IRE1 is the most conserved sensor which also has a non-canonical role in the immune system. This sensor has an endoribonuclease domain with a dual function. On one side, it mediates the unconventional splicing of the Xbp1 mRNA, which translates into a potent transcriptional factor called “XBP1 spliced” or XBP1s. On the other side, under prolongated conditions of ER stress, IRE1 mediates the degradation of additional mRNAs in a process called ‘RIDD’ (Regulated IRE1-dependent Decay). Among RIDD targets are a variety of mRNAs coding for proteins related to lysosomal biogenesis, a process responsible of activating cytotoxic lymphocytes against tumors and viruses. Nonetheless, despite this evidence, the role of IRE1 in phagolysosome function is not comprehensively understood. In this master's thesis and continuing with the work presented during the undergraduate program, the importance of the IRE1 axis in phagosomal maturation and lysosomal positioning was studied. To do this, various molecular and cellular biology techniques were used that allowed the study of the characteristics of phagosomes both at the level of the whole cell and at the level of individual organelles, allowing a multifocal approach to the problem posed. It was shown, via Flowcytometry, qPCR and Microscopy, that the expression of Lamp1 is directly modulated by the IRE1 axis by means of RIDD. Our PhagoFACS results indicate that in 5 the absence of IRE1, the phagosomes of DCs mature in an accelerated manner, since there is a greater accumulation of the Lamp1 protein and a greater degradation of the OVA antigen. Interestingly, this phenomenon is not observed in the case of XBP1-deficient cells, suggesting that the inability to cross-present in XBP1 knock-out dendritic cells reported in the literature is not due to a malfunction of phago-lysosomal maturation processes.