Estudio comparativo de las enzimas amilasas y celulasas producidas por levaduras psicrófilas y psicrotolerantes

Abstract

Los microorganismos que habitan en ambientes frios han desarrollado una serie de adaptaciones que les permiten crecer a bajas temperaturas, incluyendo la producción de enzimas extracelulares para utilizar los nutrientes disponibles. Es aceptado que estas enzimas son más activas a bajas temperaturas que sus contrapartes mesófilas. Sin embargo, las temperaturas óptimas de actividad enzimática son variables entre los grupos de microorganismos aislados desde estos ambientes, algunos presentando actividad enzimática óptima entre 22-40 °C y otros entre 0-15 °C. Se ha sugerido que las enzimas pertenecientes al primer grupo son obtenidas desde microorganismos psicrotolerantes, que han sido aislados desde ambientes frios con variaciones estacionales de temperatura, mientras que el segundo grupo se han obtenido desde microorganismos psicrófilos que han sido aislados desde ambientes fríos constantes. Dentro de este contexto, es posible hipotetizar que las enzimas producidas por levaduras psicrófilas estarían más adaptadas a las bajas temperaturas en comparación a las enzimas producidas por levaduras psicrotolerantes, basándonos en las temperaturas óptimas de crecimiento de ambos grupos de levaduras. En este trabajo se puso a prueba esta hipótesis utilizando para los estudios levaduras psicrófilas y psicrotolerantes aisladas desde la Antártica. El trabajo se enfocó en las enzimas amilasas y celulasas las cuales degradan los dos polisacáridos más abundantes del planeta y además, corresponden a las enzimas más utilizadas en la industria. En el último tiempo se ha considerado la utilización de enzimas amilasas y celulasas activas a bajas temperaturas en los procesos de producción de biocombustibles a partir de materias primas ricas en almidón y celulosa. Sin embargo, las enzimas comerciales disponibles actualmente son ineficientes para funcionar a temperatura ambiente o bajas temperaturas, lo que hace necesario subir las temperaturas del proceso encareciendo la producción de biocombustibles. En este trabajo se evaluó en primera instancia, las actividades amilasas y celulasas presentes en extractos proteicos extracelulares obtenidos de levaduras psicrófilas y psicrotolerantes, lo que permitió la selección de dos enzimas amilasas y dos enzimas celulasas, producidas por levaduras psicrófilas y psicrotolerantes, en cada caso. Se optimizaron las condiciones de crecimiento de las levaduras para la obtención de la mayor cantidad de enzimas para su posterior purificación. Las enzimas se caracterizaron en relación al pH y temperatura óptima, el efecto de iones, termoestabilidad de la actividad enzimática, y también se determinaron parámetros cinéticos. Se observó que las mayores actividades. amilasas y celulasas de las levaduras psicrófilas y psicrotolerantes se obtuvieron entre 30 y 37 °C. Sin embargo, algunas levaduras psicrófilas presentaron las mayores actividades amilasa y celulasa entre 10 y 22 °C. El calcio aumentó la actividad de la a-glucosidasa de D. fristingensis T9Df1, mientras que la actividad de las restantes enzimas no fueron afectadas por ninguno de los iones evaluados. La glucoamilasa producida por Tetracladium sp. (psicrotolerante) fue la que presentó la temperatura óptima de actividad más baja dentro de las evaluadas, siendo ésta 30 °C. Además se determinó que esta enzima posee una ku de 4,5 g/l sobre almidón soļuble, valor significativamente mayor que las Ku reportadas para las glucoamilasas de microorganismos mesófilos. De acuerdo a estos resultados, se determinó que la glucoamilasa producida por Tetracladium sp. fue la enzima que resultó estar más adaptada a las bajas temperaturas. Poг último, se modeló esta enzima con respecto a la glucoamilasa que presentó la mayor similitud de secuencia, y se determinó que la glucoamilasa descrita en este trabajo posee una serie de sustituciones aminoacídicas, que en su conjunto le confieren una mayor actividad a bajas temperaturas en relación a su contraparte mesófila. Considerando los resultados obtenidos en este trabajo se rechaza la hipótesis planteada en este trabajo ya que la amilasa obtenida desde una levadura psicrotolerante fue la que presentó la menor temperatura óptima de actividad enzimática.

Microorganisms that inhabit in cold environments have developed adaptations that allow them to grow/tolerate low and freeze temperatures, and furthermore, the secretion of hydrolytic enzymes to use the available nutrients. Although, these enzymes are more active at low temperatures than their mesophilic counterparts, their temperatures for optimum activity are variable among the groups of microorganisms isolated from these environments. Psychrotolerant microorganisms are normally isolated from cold environments with seasonal temperature variations, whiles psychrophilic microorganisms are commonly isolated from constant cold environments. The temperature described for enzymes from psychrotolerant and psychrophilic microorganisms ranger from 22-40 °C and 0-15 °C, respectively. In this context, it is possible to hypothesize that the enzymes produced by psychrophilic yeasts would be more adapted at low temperatures regarding to the enzymes produced by psychotolerant yeasts. In this work we tested this hypothesis in psychrophilic and psycho-tolerant yeasts isolated from Antarctica. The work was focused on the amylases and cellulases which degrade the two most abundant polysaccharides on the planet and also correspond to the enzymes most used in the industry. Currently, the use of low-temperature active amylases and cellulases has been considered for the production of biofuel from raw matters rich in starch and cellulose. However, the commercial enzymes currently available are inefficient to operate at room temperature or low temperatures, which makes necessary to heat the process, increasing the production costs of biofuels. The amylases and cellulase activities were evaluated in extracellular extracts obtained from yeasts, which allowed the selection of two amylases and two cellulase enzymes, produced by psychrophilic and psychotolerant yeasts, in each case. The yeast growth conditions were optimized to obtain the highest amount of enzymes for further purification. The enzymes were characterized in relation to their optimal pH and temperature for activity, thermostability of enzymatic activity, effect of metals on activity, and the kinetic parameters were determined. It was observed that the highest amylase and cellulase activities of the psychrophilic and psychotolerant yeasts were obtained between 30 and 37 °C. However, some psychrophilic yeasts had the highest amylase and cellulase activity between 10 and 22 °C. Calcium increased the activity of the a-glucosidase of D. fristingensis T9Df1, while the activity of the remaining enzymes were not affected by any of the evaluated cations. The glucoamylase produced by Tetracladium sp. was the one that presented the lowest optimum temperature of their activity, being this 30 °C. In addition, it was determined that this enzyme has a Ku of 4,5 g/l on soluble starch, a value significantly higher than the ku reported for the glucoamylases of mesophilic microorganisms. According to these results, it was determined that the glucoamylase produced by Tetracladium sp. was the enzyme that proved to be more adapted to low temperatures. This enzyme was modeled with respect to the glucoamylase that presented the greatest sequence similarity, and it was determined that the glucoamylase described in this work has a series of amino acid substitutions that confer it greater enzymatic activity than their mesophilic counterpart. Considering the results obtained we reject the hypothesis proposed in this work since the amylase obtained from a psychotolerant yeast was the one with the lowest optimum temperature of enzymatic activity.