Composición y función de las comunidades microbianas involucradas en el ciclo del nitrógeno en suelo de Phaseolus vulgaris

Abstract

La comprensión de la relación existente entre la diversidad microbiana y el papel biológico que cumple la microbiota en el ambiente es uno de los principales retos en ecologia microbiana. En este trabajo se analizó el efecto rizosférico de Phaseolus vulgaris sobre la composición y función de los diferentes grupos microbianos involucrados en las principales etapas del ciclo del nitrógeno. A su vez, diferentes condiciones de riego, incluyendo o no la adición de nitrato, fueron evaluadas con el fin de definir si el nitrato afecta el establecimiento de la simbiosis en la planta o los otros procesos asociados con la conversión de nitrógeno. La composición de los grupos microbianos que participan en fijación de nitrógeno, nitrificación o desnitrificación, fue determinada mediante la amplificación de genes funcionales especificos y la posterior resolución de las mezclas de amplicones por DGGE o T-RFLP así como mediante clonación y secuenciación. Partidores especificos previamente publicados en la literatura para la amplificación de 16S rDNA y diferentes genes funcionales (amoA, nirS, nirK y nifH) fueron utilizados para analizar la composición de las comunidades de bacterias nitrificantes, desnitrificantes y el gremio de bacterias fijadoras de nitrógeno. En el caso de las bacterias fijadoras de nitrógeno, se diseñó además partidores específicos para la amplificación de dos genes que codifican para subunidades funcionales de la nitrogenasa (nifD y nifH) en bacterias rizobiales. Estos partidores fueron probados en poblaciones de bacterias rizobiales del suelo (vida libre) así como en poblaciones de microsimbiontes. La especificidad de los productos de PCR obtenidos fue confirmada mediante secuenciación.

Los resultados mostraron claramente el efecto rizosférico de la planta leguminosa y de las condiciones de riego sobre la composición y función de algunos grupos microbianos que participan en el ciclo del nitrógeno (por ejemplo, bacterias nitrificantes o bacterias rizobiales). Por el contrario, los cambios en la composición de la comunidad bacteriana total y en el gremio de diazótrofos no se correlacionaron claramente con el efecto rizosférico. La amplificación de marcadores moleculares específicos para bacterias desnitrificantes (nirs y nirk) no fue posible a pesar de las diferentes estrategias ensayadas. Sin embargo, las tasas de desnitrificación in situ mostraron que la actividad de este grupo está fuertemente influenciada por la presencia de la planta. Adicionalmente, el análisis de las poblaciones simbióticas en nódulos de P. vulgaris mostró que las bacterias rizobiales asociadas con la planta presentan baja variabilidad. No obstante, se observó diferencias entre las bacterias cultivadas desde los nódulos y los resultados obtenidos al analizar extractos directos de DNA de nódulo. Asimismo, la presencia de posibles bacterias nitrificates en los nódulos fue determinada por PCR y FISH, pero se desconoce el papel que estos microorganismos puedan estar cumpliendo en ese hábitat.

The understanding of the relationship between microbial diversity and the biological role of microbial communities is one of the main challenges in microbial ecology. We analyzed the rhizospheric effect of Phaseolus vulgaris on the composition and function of microorganisms involved in the main stages of the nitrogen cycle. Different watering conditions, considering either the addition or not of nitrate, were evaluated as well, in order to analyze its effect on the establishment of the symbiosis and on all the other processes affected by nitrate in the nitrogen conversion. The composition of microorganisms performing nitrogen fixation, nitrification and denitrification was determined by amplification of selected genes by PCR and subsequent resolution of amplicons mixtures by DGGE or T-RFLP, as well as by cloning and sequencing. Previously published PCR primers for 16S rDNA and different functional genes (amoA, nirS, nirk, and nifH) were used to analyze nitrifying and denitrifying bacteria and the diazotroph guild. In the case of nitrogen fixing bacteria, we designed new specific primers for the amplification of two genes encoding for structural subunits of nitrogenase (nifD and niffH) in rhizobial bacteria. These primers were tested on free-living and symbiotic rhizobial populations. Sequences of PCR products obtained with these primers were determined confirming the retrieval of the expected targets. Overall, the results showed the effect of the rhizosphere and the watering conditions on the composition and function of microorganisms involved in the nitrogen cycle such as nitrifiers or rhizobial bacteria. In contras, the changes on the composition of bacterial communities and diazotroph guild did not correlate with the treatments assayed. Analyzing denitrifying bacteria, different strategies failed to amplify the specific functional markers (nitrite reductase genes, nirS and nirK). Nevertheless, denitrification rates showed that the activity of this group was strongly altered by the presence of the plants. Additionally, analysis of symbiotic communities showed that rhizobia associated with P. vulgaris displayed very low variability, even though, we observed differences between isolated bacteria obtained from the nodules and direct analysis of DNA nodules extracts. The unexpected presence of possible nitrifying bacteria in the nodules was determined by PCR and FISH, but the role of these microorganisms remains undetermined.