Caracterización de la vía del c-di-GMP y de su relación con los fenotipos de adherencia y motilidad en la bacteria biominera Acidithiobacillus caldus: el desafío de construir el mutante nulo ?ACA_1413

Abstract

Acidithiobacillus caldus es una bacteria Gram-negativa, acidófila, quimiolitiautotrófica que obtiene energía mediante la oxidación de compuestos reducidos de azufre. El metabolismo de este microorganismo extremófilo está directamente relacionado con procesos de importancia ecológica, así como también con la técnica biotecnológica de recuperación de metales preciosos desde minerales Ilamada biolixiviación. La adherencia celular y posterior formación de biopelículas sobre la superficie de los minerales contribuye a acelerar estos procesos, por lo que entender los mecanismos moleculares que regulan la formación de este tipo de estructuras multicelulares se torna relevante. En diferentes especies bacterianas, el mensajero secundario diguanilato cíclico (c-di-GMP) promueve la transición desde el estado planctónico motil al estado multicelular adherido, favoreciendo la síntesis de exopolisacáridos e inhibiendo la motilidad a través de diversos efectores. Los niveles intracelulares de c-di-GMP están regulados por el balance de las actividades diguanilato ciclasas (DGCs) y fosfodiesterasas (PDEs), las que sintetizan y degradan el c-di-GMP, respectivamente. La actividad DGC reside en el dominio proteico GGDEF, mientras que la actividad PDE reside en los dominios EAL y HD-GYP. Si bien estos dominios juegan un rol fundamental en el metabolismo del c-di-GMP, también pueden actuar como efectores de la vía uniendo directamente esta molécula. En esta tesis, se caracterizó una vía funcional mediante c-di-GMP en At. caldus, la cual regula los fenotipos de adherencia y motilidad en este microorganismo. En un inicio, análisis bioinformáticos de la secuencia genómica de la cepa ATCC 51756 de At. caldus se identificaron genes que codifican proteínas involucradas con el metabolismo del c-d-GMP. Nueve de ellos contienen un dominio GGDEF, tres contienen un dominio EAL y seis contienen ambos dominios (GGDEF-EAL). Basado en la presencia de aminoácidos clave en las actividades DGC y PDE, se predijo que siete de los nueve dominios EAL serían funcionales como PDEs y once de los quince dominios GGDEF serían funcionales como DGCs. De los cuatro dominios GGDEF predichos como no funcionales, sólo uno, contenido en la proteína ACA_1412, podría actuar como efector de la vía del c-di-GMP. Además, se identificaron otros efectores putativos, algunos de los cuales estarían involucrados en la síntesis de sustancias poliméricas extracelulares (SPEs). Se identificó un homólogo del efector PelD de P. aeruginosa, el que conserva los aminoácidos importantes para la unión de c-di-GMP y un contexto génico similar al operón pel de P. aeruginosa, cuyos siete genes codifican para proteínas esenciales para la síntesis del polisacárido PEL. También, se identificaron ocho genes que codifican proteínas efectoras con dominio PilZ, seis de los cuales poseen los motivos aminoacídicos descritos para la unión del c-di-GMP. Entre éstos, destacan cuatro proteínas con homología a proteínas de ensamble del pili tipo IV y un homologo a la subunidad A de celulosa sintasa (BcsA). Experimentos de transcripción reversa determinaron que, a excepción de un ORF que codificaría para una proteína con dominio PilZ, todos los genes involucrados con la vía del c-di-GMP identificados en At. caldus se expresan, sugiriendo fuertemente que este microorganismo cuenta con los elementos necesarios para establecer una vía funcional mediante c-di-GMP. El análisis de extractos ricos en nucleótidos obtenidos desde At. caldus mediante espectrometría de masas reveló la presencia de c-di-GMP, indicando que este microorganismo tiene la capacidad de sintetizar este segundo mensajero, y por lo tanto, posee una o más DGCs funcionales. Utilizando ensayos de complementación fenotípica en enterobacterias, se demostró la funcionalidad de cinco dominios GGDEF, dentro de las cuales destacó la DGC ACA_1413 por su categórica respuesta. La cuantificación de los niveles de c-di-GMP en cepas de Salmonella typhimurium indicó que la cantidad del segundo mensajero producida por las células que expresan el gen aca_1413 es cerca de nueve veces mayor que la observada en los extractos de las células control transformadas sólo con el plasmidio, lo que comprobó que ACA_1413 es una DGC funcional y que el fenotipo observado se debe a la alta concentración de c-di-GMP intracelular producida por esta proteína. Para indagar si la señalización mediante c-di-GMP en At. caldus participa en la regulación de los fenotipos de adherencia y/o motilidad, se construyó una cepa mutante en la DGC ACA_1413 y se evaluaron dichos fenotipos en las cepas silvestre y mutante. La inactivación cromosómica del gen aca_1413 fue generada mediante la técnica llamada "mutación por intercambio de marcador". La mutación fue comprobada mediante análisis de "colony blot" y "Southern blot". El estudio comparativo de los niveles de c-di-GMP entre la cepa silvestre y la cepа ДАСА_1413 de At. caldus mediante espectrometría de masas determinó que la cepa AАСА_1413 produce 3,5 veces menos c-diGMP que la cepa silvestre. Además, este resultado reveló que la DGC ACA_1413 es responsable del 71,6% de la producción total de c-di-GMP, sugiriendo que la DGC ACA_1413 podría jugar un rol central en la vía del c-di-GMP en At. caldus, y también, en correlación con el análisis bioinformático, indicó que existen otras DGCs actuando en paralelo. Ensayos fenotípicos de las cepas silvestre y ДАСА_1413 de At. caldus sugieren que la DGC ACA_1413 favorece la adherencia a sustrato sólido e inhibe la motilidad flagelar de esta bacteria. La adherencia a azufre elemental fue evaluada directamente mediante microscopía de fluorescencia y microscopía electrónica de barrido, e indirectamente cuantificando las células planctónicas remanentes en los cultivos. Mediante estos ensayos, se determinó que en comparación con la cepa silvestre, la cepa mutante posee una menor capacidad para adherirse al azufre a tiempos cortos de incubación con el sustrato (≤1 h). Por otro lado, ensayos de motilidad tipo "swarming" en medio semisólido, establecieron que la ceра ДАСА_1413 presenta un nivel de motilidad mayor que la cepa silvestre. El mecanismo por el cual la DGC ACA_1413 afecta estos fenotipos es aún desconocido, sin embargo el efecto en la adherencia podría explicarse por efectores putativos homólogos a PelD, BcsA y proteínas de ensamble del pili tipo IV. Además, el contexto génico de aca_1413 indica que ACA_1413 podría regular el funcionamiento del flagelo. Efectivamente, río abajo de aca_1413 se ubica un gen predicho para codificar la única una proteína con un dominio GGDEF capaz de actuar como efector de la vía (ACA_1412), mientras que río arriba, se encuentran genes que codifican copias de FliL, MotA y MotB. ACA_1412 podría entonces actuar como efector uniendo el c-di-GMP sintetizado por ACA_1413, reprimiendo la motilidad interviniendo en el funcionamiento de alguno de estos elementos.

Acidithiobacillus caldus is an acidophilic chemolithoautotrophic bacterium that obtains energy from the oxidation of reduced inorganic sulfur compounds (RISCs). At. caldus metabolism is related directly with ecologic phenomena and bioleaching, a biotechnological application by which valuable metals are recovered from insoluble ores. Bacterial attachment and subsequent biofilm formation on the mineral surface contributes to accelerating these processes, therefore the understanding of molecular mechanisms that regulate the formation of such multicellular structures becomes relevant. Different bacteria use the second messenger cyclic diguanylate (c-di-GMP) to promote the transition from motile planktonic state to the attached multicellular state, by promoting exopolysaccharide synthesis and inhibiting different classes of motility. Intracellular levels of c-di-GMP are regulated by the balance of diguanylate cyclase (DGCs) and phosphodiesterase (PDEs) activities, which synthesize and degrade c-di-GMP, respectively. The DGC activity resides in the GGDEF protein domain, while PDE activity resides in two different domains: EAL and HD-GYP. These three domains play an important role in c-di-GMP metabolism, but also can act like effector proteins by c-di-GMP binding. In this thesis, a functional c-di-GMP pathway was characterized in At. caldus, which regulates motility and attachment of this bacterium. By performing a bioinformatic analysis on the genomic sequence of At. caldus ATCC51756, several genes involved in the c-di-GMP pathway were identified. Nine of them contain a GGDEF domain, three contains an EAL domain, and six contain both GGDEF and EAL domains. Based in the presence of key aminoacids it was predicted that seven out of nine EAL domains could be functional as PDEs, while eleven out of fiveteen GGDEF domains could be functional as DGCs. From the four GGDEF domain predicted as non fuctional DGCs, only one, contained in ACA_1412 protein, could act as effector of c-di-GMP pathway. Also, putative effector proteins related to synthesis of extracellular polymeric substances were identified. An orthologue of PelD form P. aeruginosa which conserves key aminoacids needed for c-di-GMP binding was identified. It bears a similar genetic context to that of the corresponding pel operon, whose seven genes (pelA-G) are involved in PEL polysaccharide synthesis. Additionally, eight genes coding proteins containing PilZ domains were identified, six of which have key aminoacids for c-di-GMP binding. Among them, four proteins related to type four pili (T4P) assembly and one orthologue of cellulose catalytic subunit A (BcsA) were found. Reverse transcription experiment determined that, except for one PilZ coding ORF, every c-di-GMP related gene detected was transcribed strongly in At. caldus, suggesting that this bacterium have enough elements to construct a functional c-di-GMP pathway. Mass spectrometry analysis of nucleotide extracts from At. caldus cells showed the presence of cdi-GMP, indicating that this microorganism is capable to produce it and therefore it posseses one o more functional DGCs. By using phenotypic complementation assays in enterobacteria, five GGDEF domains were characterized as functional DGCs. Among them, the GGDEF domain-containing protein ACA_1413, showed the strongest phenotype. Quantification of c-di-GMP levels in Salmonella typhimurium strains indicated that the amount of c-di-GMP produced by cells expressing aca_1413 gene is about nine times higher than control cells. This proved that ACA_1413 is a functional DGC, and the phenotype observed is due to high concentration of intracellular c-di-GMP produced by this protein. To investigate if c-di-GMP signaling in At. caldus participates in the regulation of attachment and/or motility phenotypes, a mutant strain deficient in the ACA_1413 DGC was constructed. The chromosomal inactivation of aca_1413 gene was generated by marker exchange mutagenesis. The insertion was verified by colony blot and Southern blot. Comparative quantification of c-di-GMP levels by mass spectrometry determined that the AАСA_1413 mutant strain of At. caldus produces about 3,5 times less than the wild type strain. Furthermore, this result revealed that ACA 1413 DGC is responsible for 71,6% of c-di-GMP production, suggesting that this DGC could play a pivotal rol in cdi-GMP pathway in At. caldus.Moreover, in agreement with the bioinformatic this analysis indicates that there are other functional DGCs acting in parallel. Comparative phenotypic assays suggested that ACA_1413 induce attachment to solid substrate and inhibit flagellar motility. Attachment to sulfur surface was evaluated directly by fluorescence and scanning electron microscopy, and indirectly by quantification of remaining planctonic cells in the culture. By these assays it was determined that, compared to the wild type strain, the AАCA_1413 strongly has a decreased ability to attach to sulfur at short times of incubation with substrate (≤1 h). On the other hand, the AACA_1413 mutant strain showed a higher degree of motility in swarming assays on semisolid media. The mechanism by which ACA_1413 DGCs act on these phenotypes is still unknown. One possibility is that the attachment effect is mediated by T4P, PelD and/or BcsA putative effector proteins. Additionally, the genetic context of aca_1413 gene suggests its involvement in flagella functioning. This is plausible due the presence of the aca 1412 gene downstream, which is predicted to encode the only GGDEF protein capable to act as effector of c-di-GMP pathway, while upstream there are copies of fliL, motA, and motB flagellar genes. Then, ACA_1412 can act as an effector by binding c-di-GMP produced by ACA_1413, inhibiting swarming motility by interfering with some of these elements.