Diversidad genética de las poblaciones de Frankia y de bacterias fijadoras de nitrógeno en la rizosfera de Colletia hystrix

Abstract

Bacteria of the genus Frankia play a very important role in soil by inducing nitrogen-fixing nodules on the roots of non-leguminous plants named actinorhizal plants. They are a diverse group of trees and shrubs that grow in different habitats. Some actinorhizal plants are a significant component of the matorral in Central Chile, among them Colletia hystrix (Rhamnaceae). The main objective of this thesis was to determine the genetic diversity of uncultured Frankia growing in both habitats (nodules and soil) and to evaluate the importance of Frankia within the nitrogen-fixing bacterial guild and in the total soil microbial community. The studied site was located in El Romeral (Cajón del Maipo, Chile). Eighty-eight samples of root nodules from C. hystrix and fifteen samples of rhizosphere soil from the same host plants, non-actinorhizal plants and soil without plants were used. RFLP-PCR analysis in the intergenic region IGS rn and nifwas used as a means to estimate molecular diversity of Frankia in actinorhizal nodules. A HaellI digestion of the PCR product allowed us to identify PCR-RFLP groups or haplotypes among the Colletia-infective Frankia strains tested. Fifteen haplotypes were recognized on the basis of combining the restriction patterns in each region analyzed. The data showed that the microsymbionts associated to each host plant exhibited unique haplotypes, except the haplotype A3 which was observed in all the host plants with a high frequency. This haplotype was also exhibited by strain Chl4, isolated in 1991 in the same locality indicating that it is the most common haplotype in this area and very stable over time. The genetic diversity observed among the microsymbionts is organized in at least three groups which exhibited a major genetic differentiation indicating a spatial heterogeneity in the population. The data also showed that the genetic diversity of these natural populations of Frankia is organized in a limited number of clones in a nonrandom association of DNA fingerprinting of both genomic regions, suggesting that the genetic structure of the populations can be considered as clonal. In the Frankia populations of soil, we found a high number of Frankia genome units (5.6 x 106 GU/g soil) associated to the rhizosphere of C. hystrix and a lower number (5-6 x 10 GU/g soil). in soil without plants. However, in the characterization of Frankia populations in soil by SSCP analysis, richness observed as a means of estimating total genotype SSCP of Frankia was greater in soil than in rhizosphere soil. We found nine SSCP genotypes in all sites, but only one SSCP genotype (G1) was distributed in all the Frankia soil populations. This genotype was also exhibited by strain Chl4. We have also analyzed the variability in bacterial nifH and 16S rRNA genes by TRFLP analysis from soil samples and rhizosphere as a means to estimate molecular diversity of nitrogen-fixing bacteria, and microbial community. We found that each of the three clusters of nitrogen-fixing populations corresponded to the three habitats studied. While the microbial community evenness and richness was similar in rhizosphere soil of C. hystrix.

Las bacterias del género Frankiafijan nitrógeno en su estado de vida libre en el suelo y en simbiosis con plantas no leguminosas. Algunas de estas plantas son componentes importantes del matorral esclerófilo de Chile central, como es el caso de Colletia hystrix (Rhamnaceae). El principal objetivo de esta tesis fue el determinar la estructura genética de las poblaciones de Frankia en sus dos habitats (nódulos y suelo) y evaluar la diversidad genética del grupo de diazótrofos y la comunidad bacteriana total asociada a la simbiosis actinorrícica. El sitio de estudio se localizó en "El Romeral" (Cajón del Maipo, Chile). Se colectó un total de 88 nódulos radiculares de C. hystrix y 15 muestras de suelo provenientes de la rizósfera de C. hystrix (planta hospedera), de plantas nohospederas y de suelo sin cobertura vegetal. El polimorfismo de la regiones intergénicas (IGS) rrn y nif reveló 15 haplotipos RFLP en la población de microsimbionte de Frankia (en el nódulo) asociados a Colletia hystrix. Todos los haplotipos fueron exclusivos de cada planta hospedera excepto el haplotipo A3, el cual fue común a todas las plantas y presentó la mayor frecuencia. La cepa Chl4, aislada en la misma localidad en 1991, presenta el haplotipo A3, indicando que este haplotipo es común en esta área y estable en el tiempo. En la población microsimbionte se determinaron al menos tres grupos genéticamente distintos indicando que existe una heterogeneidad espacial en la población. Adicionalmente, la diversidad genética observada se organizó en un número limitado de haplotipos, lo que nos sugiere que la estructura genética de la población microsimbionte puede ser considerada principalmente clonal, es decir que la variabilidad genética de la población se debe a mutaciones más que recombinación genética. a La población actinomicete de Frankia (población de vida libre) se estudió en la rizosfera de su planta hospedera, no-hospedera y en suelo sin cubierta vegetal. La abundancia medida como unidades genómicas fue mayor en la rizósfera de Colletia hystrix (5,6 x 106 UG/g suelo) que en el suelo sin plantas (5-6 x 104 UG/g suelo). La riqueza genética de la población actinomicete se determinó por el polimorfismo de la región IGSrrn que reveló 9 perfiles SSCP. Uno de los perfiles (G1) coincide con el patrón de la cepas Chl4 y además se encuentra presente en los tres habitat estudiados Contrariamente, a los resultados de la abundancia, la rizósfera de las plantas hospederas presentaron la menor riqueza de genotipos, probablemente como consecuencia de una selección de los genotipos más infectivos por efecto de la planta. Además se determinó el polimorfismo del "pool" de genes niffI de la rizosfera y en el suelo mediante T-RFLP, para evaluar la diversidad genética de las bacteria fijadoras de nitrógeno (gremio o grupo funcional) y el polimorfismo de los genes rDNA 16S para la comunidad bacteriana total. Los resultados indican que los diazótrofos forman tres grupos, uno reune a todas las muestras de suelo, el segundo agrupa muestra de rizófora de C. hystrix y el tercero agrupa todas las muestras de plantas no-actinorrícas. A mayor nivel de organización ecológica observamos menos homogeneidad entre las muestras de las comunidades microbianas. Sólo la rizosfera de Colletia hystrix forman un grupo bien definido.