Efecto de cobre y cadmio en el metabolismo de los polifosfatos y en la expresión global de proteínas en el arqueón sulfolobus metallicus

Abstract

Sulfolobus metallicus es un arqueón termoacidófilo que crece bajo condiciones ambientales extremas, tales como pH ácido y altos niveles de metales tóxicos, y es de gran importancia en procesos de biominería. Los metales pesados son importantes 'cofactores de muchas enzimas involucradas en diversos procesos celulares. Mientras que cantidades trazas de metales son esenciales para la vida, un exceso es tóxico para las células. Los microorganismos que habitan ambientes con altas concentraciones de metales pesados se encuentran con una presión selectiva para desarrollar eficientes mecanismos de resistencia a metales, y muchos microorganismos acidófilos son resistentes a concentraciones de metales tóxicos que superan los niveles de resistencia de los microorganismos neutrófilos. Los mecanismos genéticos y bioquímicos responsables para la resistencia a metales en arqueas acidófilas no se han caracterizado. Por lo tanto, nos interesamos en el estudio de mecanismos globales de respuesta a estrés por metales pesados en S. metallicus. Los polifosfatos inorgánicos (poliP) son polímeros lineales de residuos de ortofosfato, los cuales son observados frecuentemente como gránulos densos al paso de los electrones y están presentes en muchos organismos incluyendo bacterias, arqueas y eucariontes. Los poliP tienen una variedad de funciones fisiológicas, y se ha propuesto que estos polímeros pueden funcionar como un mecanismo bacterial de tolerancia a metales pesados. En este mecanismo, la hidrólisis del polímero y el transporte de complejos metal-Pi fuera de las células podrían ser los pasos fundamentales. Para estudiar si este sistema existe en arqueas, en esta Tesis estudiamos el posible papel del metabolismo de los poliP en la respuesta adaptativa de S. metallicus en tolerar metales pesados (Cu2+ and Cd+2). La presencia de poliP se determinó mediante microscopía electrónica, espectroscopía de pérdida de energía del electrón (EELS), y además se cuantificaron usando un método enzimático específico en S. metallicus, Sulfolobus solfataricus y Sulfolobus acidocaldarius. Los tres microorganismos sintetizaron poliP durante su crecimiento, pero sólo S. metallicus acumuló gránulos de poliP y altos niveles de este polímero (180 nmoles/mg de proteína, expresado como residuos de Pi). Además, detectamos en S. metallicus una actividad tipo exopolifosfatasa (PPX) asociada a extractos de membranas, y estos valores fueron similares a los descritos para la actividad PPX de S. solfataricus. Las diferencias en la capacidad de acumular poliP entre estas arqueas puede reflejar sus respuestas adaptativas a sus ambientes naturales. S. metallicus creció y toleró hasta 200 mM de sulfato de cobre, y los niveles de poliP disminuyeron al incrementar la concentración de cobre. Por otro lado, S. solfataricus no creció y no toleró concentraciones de sulfato de cobre mayores que 1-5 mM, posiblemente debido a los bajos niveles de poliP que presenta. Además, S. metallicus creció en presencia de concentraciones de sulfato de cadmio superiores a 1 mM. El traspaso de células de S. metallicus a 100 mM de sulfato de cobre produjo un rápido incremento en la actividad tipo PPX, la cual fue concomitante en el tiempo con la disminución en los niveles de poliP y la estimulación del eflujo de fosfato. Sin embargo, el traspaso de células de S. metallicus a 20 mM de sulfato de cadmio produjo una débil disminución en los niveles de poliP. Sumado a lo anterior, el cobre estimuló fuertemente la actividad tipo PPX en extractos libres de células desde S. metallicus, en un rango de 10 µM, y otros metales tales como cadmio y zinc también estimularon la actividad tipo PPX. Los resultados sugieren fuertemente que un mecanismos de tolerancia a metales mediado por poliP es funcional en S. metallicus. Esta capacidad de acumular e hidrolizar poliP puede jugar un importante papel no solo en la sobrevivencia de este microorganismo en ambientes de minerales sulfurados conteniendo altas concentraciones de metales tóxicos, si no que también en su aplicación en procesos de biominería. Con el objetivo de encontrar nuevos mecanismos responsables de la resistencia a metales en S. metallicus utilizamos una aproximación proteómica para analizar la expresión diferencial de proteínas en células expuestas a Cut2 y Cd+2. Este estudio reveló la disminución en la expresión de 23 proteínas y un aumento en la expresión de alrededor de 31 proteínas cuando las células se traspasaron a cobre. Observamos un comportamiento similar cuando las células se traspasaron a cadmio. 18 proteínas inducidas desde células expuestas a cobre se analizaron por espectroscopía de masa, y se encontró que estas estaban relacionadas con la producción y transporte de energía, la biosíntesis de aminoácidos, la respuesta a estrés, y la regulación de la transcripción. 9 de las proteínas inducidas se definieron como proteínas con funciones desconocidas. Se identificaron proteínas involucradas en el transporte de electrones, como oxidoreductasas que responderían al estrés oxidativo causado por metales pesados, yу proteínas involucradas en estrés tales como la subunidad de la chaperonina HSP60 y del proteosoma, las que jugarían un importante papel en asegurar la calidad y funcionalidad de las proteínas. Algunas de estas proteínas también se indujeron cuando las células se expusieron a cadmio. El amplio espectro funcional que entregaron las proteínas sobreexpresadas es consistente con otros estudios proteómicos recientes relacionados con la resistencia a metales pesados en otros procariontes y en el arqueón acidófilo Ferroplasma acidarmanus. Finalmente, este estudio constituye la primera caracterización proteómica de mecanismos de resistencia a metales pesados en un microorganismo termoacidófilo involucrado en procesos de biominería.

Sulfolobus metallicus is a thermoacidophilic archaeon of great importance for biomining operations. It grows under extreme environmental conditions such as acidic pH and presence of high levels of toxic metals. Heavy metals are important co-factors for many enzymes involved in diverse cellular processes. While trace amounts of metals are essential for life, high amounts are toxic for cells. Microorganisms inhabiting environments with high heavy metals concentrations encounter a selective pressure to develop metal resistance mechanisms, and many acidophilic microorganisms are resistant to concentrations of toxic metals that exceed the levels of resistance in neutrophilic microorganisms. The genetic and biochemical mechanisms responsible for metal resistance in acidophilic archaea remain largely uncharacterized. Therefore, we were interested to study global mechanisms of response to heavy metals stress in S. metallicus. Inorganic polyphosphates (polyP) are linear polymers of orthophosphate residues, which are frequently observed as electrondense granules and are present in most organisms including bacteria, archaea and eukaryotes. PolyP has a variety of physiological functions, and it has been proposed that they can work like a bacterial mechanism for heavy metals tolerance. In this mechanism, the hydrolysis of the polymer and the transport of a metal-Pi complex out of the cell are essential. To study if such a system exists in archaea, in this Thesis we studied the possible role of polyP metabolism in the adaptive response of S. metallicus tolerance to the heavy metals Cu2+ and Cd+2. The presence of polyP was determined by electron microscopy and electron energy loss spectroscoрy (EELS) procedures, and quantified by using a specific enzymatic method in S. metallicus, Sulfolobus solfataricus and Sulfolobus acidocaldarius. All three microorganisms synthesized polyP during growth, but only S. metallicus greatly accumulated granules of polyP, with polyP levels of 180 nmoles/mg of protein (expressed as Pi residues). Also, we detected in S. metallicus an exopolyphosphatase (PPX-like) activity associated to membrane extracts similar to the PPX activity found in S. solfataricus. The differences in the capacity to accumulate polyP between these archaea may reflect adaptive responses to their natural environment. S. metallicus grew in and tolerated up to 200 mM copper sulfate, and its polyP levels decreased with increasing copper concentrations. On the other hand, S. solfataricus could not grow in or tolerate more than 1-5 mM copper sulfate, most likely due to its low levels of polyP. Also, S. metallicus could grow in the presence of cadmium sulfate concentrations up to 1 mM. Shifting S. metallicus cells to copper sulfate concentrations up to 100 mM led to a rapid increase in their PPX-like activity which was concomitant in time with a decrease in their polyP levels and a stimulation of phosphate efflux. However, shifting S. metallicus cells to 20 mM cadmium sulfate led to a weak decrease in their polyP levels. Furthermore, copper in the range of 10 µM greatly stimulated PPX-like activity in cellfree extracts from S. metallicus. Other metals such as cadmium and zinc also stimulated the PPX-like activity. These results strongly suggest that a metal tolerance mechanism mediated through polyP is functional in S. metallicus. This ability to accumulate and hydrolyze polyP may to play an important role not only in the survival of this microorganism in sulfidic mineral environments containing high toxic metals concentrations, but also in their applications in biomining. To find new genetic mechanisms responsible for metal resistance in S. metallicus, we used a proteomic approach. The differential expression of proteins in cells exposed to Cut2 and Cd+² revealed the repression of 23 proteins and the induction of around 31 proteins when cells were shifted to copper. We observed a similar behavior when cells were shifted to cadmium. 18 Copper-induced proteins were analyzed by mass spectrometry, and they were found to be related to the production and transport of energy, biosynthesis of amino acids, stress responses and transcription regulation. Nine of the copper-induced proteins were defined as proteins with unknown functions. Some proteins identified were related to electron transport and were putative oxidoreductases that could respond to oxidative stress caused by heavy metals. Others proteins had similarities to proteins involved in stress responses such as the subunits of HSP60 chaperonine and proteosome. All these proteins would play important roles in assuring the quality and functions of cell proteins. Some of these proteins were also induced when cells were exposed to cadmium. The broad functional spectrum of up-regulated proteins is consistent with other recent proteomic reports concerned with heavy metals resistance in other prokaryotes and in the acidophilic archaeon Ferroplasma acidarmanus. Finally, this study constitutes the first proteomic characterization of heavy metals resistance mechanisms in a thermoacidophilic microorganism involved in biomining processes.