Estudios proteómicos y genómicos del metabolismo de compuestos azufrados en el microorganismo acidófilo quimiolitotrófico Acidithiobacillus ferrooxidan

Abstract

Acidithiobacillus ferrooxidans (ex Thiobacillus ferrooxidans) es una bacteria acidófila y quimiolitotrófica que oxida el ion ferroso, azufre elemental y compuestos de azufre reducidos como fuentes de energía. Éste y otros microorganismos tienen la habilidad de solubilizar el metal de los sulfuros metálicos por lo que son exitosamente utilizados en operaciones de biominería. Se han propuesto dos mecanismos para la disolución de los sulfuros metálicos: el directo e indirecto. En el primero, la bacteria oxida directamente el mineral, sin la participación de los iones férrico. Evidencias recientes apoyan al mecanismo indirecto. Se postula que los sulfuros metálicos serían degradados por el ataque químico de iones Fe(III) y/o protones. El mecanismo de degradación está determinado por la estructura cristalina del mineral. De acuerdo al modelo propuesto, el tiosulfato sería el intermediario principal de la oxidación de la pirita (FeS2) y otros sulfuros similares. En este proceso de disolución, los iones Fe(III) son los únicos agentes oxidantes. Esto explicaría porqué sólo las bacterias que oxidan iones Fe(II) son capaces de oxidar este tipo de sulfuros metálicos. En cambio, los sulfuros metálicos como la esfalerita (ZnS) y otros relacionados, son degradados mediante el ataque de los iones Fe(III) y los protones. En consecuencia, los intermediarios principales son los polisulfuros y el azufre elemental. Ya que el tiosulfato es el producto intermediario principal en la oxidación del residuo azufrado de la pirita, el mecanismo ha sido recientemente denominado como el mecanismo del tiosulfato. Se ha demostrado que todas las reacciones que ocurrirían en este mecanismo pueden deberse sólo a bases eminentemente químicas. Sin embargo, las enzimas que oxidan compuestos azufrados como la tiosulfato deshidrogenasa de A. ferrooxidans podrían también estar involucradas. Además, las enzimas que oxidan el tiosulfato o el sulfito de A. ferrooxidans podrían competir exitosamente con la reacciones químicas de los iones Fe(III). La actividad rodanasa ha sido anteriormente descrita en A. ferrooxidans. Esta enzima es una tiosulfato azufre transferasa que rompe el enlace S-S del tiosulfato, produciendo azufre y sulfito. Las rodanasas catalizan in vitro la transferencia del átomo de azufre sulfano del tiosulfato al cianuro. Previamente nosotros hemos estudiado los cambios globales en la expresión de proteínas cuando A. ferrooxidans ATCC 19859 crece en ion ferroso o azufre elemental y hemos identificado algunas de estas proteínas. Durante esta tesis, con el objetivo de caracterizar los componentes involucrados en la oxidación del tiosulfato y otros sulfuros metálicos, hemos analizado mediante electroforesis bidimensional en condiciones de no equilibrio (2D NEPHGE) y Western blot las proteínas que sintetiza A. ferrooxidans cuando crece en iones Fe(II), azufre elemental, pirita, tiosulfato, ZnS y CuS. Analizamos la expresión de una proteína de 21 kDa (P21) cuya síntesis se incrementa enormemente cuando el microorganismo crece en FeS2, tiosulfato, azufre elemental, CuS y ZnSs y se encuentra completamente reprimida cuando crece en ion ferroso. Posteriormente determinamos la secuencia de aminoácidos del extremo amino terminal de la proteína P21 y usamos la secuencia genómica preliminar de la cepa de A. ferrooxidans ATCC 23270 disponible vía internet para identificar y aislar la región del DNA que contiene el gen p21. La secuencia nucleotídica de este fragmento de DNA kDa. La diferencia en el tamaño se debe a la presencia de un posible péptido señal en el ORF que codifica para la P21. Cuando el gen p21 se clonó y sobreexpresó en Escherichia coli, el péptido señal fue removido, dando como resultado la proteína madura de 21 kDa. La proteína P21 exhibe una elevada similitud con otras tiosulfato azufre transferasas cuyas actividades han sido demostradas in vitro. Además, ésta contiene altamente conservados los dominios estructurales CH2A, CH2B y el sitio activo, típico de las tiosulfato azufre transferasas. Sin embargo, la proteína P21 recombinante no mostró actividad. A diferencia de las rodanasas citoplasmáticas, la proteína P21 fue localizada mediante análisis inmunocitoquímico en la periferia de las células de A. ferrooxidans y su síntesis se regula en forma dependiente del sustrato oxidable. En el contexto genómico del gen p21 se encuentran otros ORFs que codificarían para proteínas de unión a sulfato-tiosulfato y una tioredoxina. Estos resultados sugieren que la proteína P21 se encontraría involucrada en el metabolismo de compuestos azufrados en A. ferrooxidans. Aunque todavía no se ha demostrado, esta proteína puede ser parte importante del mecanismo indirecto del tiosulfato para la disolución de los minerales y/o del metabolismo de azufre en A. ferrooxidans. Usando la misma estrategia de genética reversa identificamos el gen que codifica para una proteína de 33 kDa que se induce cuando la bacteria crece en tiosulfato en relación a ion ferroso. El gen p33 se encuentra río arriba del gen p21. Encontramos la actividad rodanasa en los extractos totales de células de A. ferrooxidans, lo que sugiere la existencia de una proteína TST. Por esta razón, mediante el uso de herramientas bioinformáticas, investigamos en el genoma incompleto de A. ferrooxidans ATCC 23270 la existencia de otras proteínas similares a rodanasas. Como resultado de esta búsqueda se caracterizó preliminarmente una proteína de 14 kDa que tiene actividad rodanasa. A. ferrooxidans posee al menos otros dos genes que codifican para una proteína que contienen dominios presentes en la superfamilia de rodanasas, pero que posiblemente desempeñan otras funciones celulares. En conclusión, debido a la ausencia de un sistema genético apropiado para realizar genómica funcional en A. ferrooxidans, hasta este momento no ha sido posible asignar una función definitiva a la proteína P21 en el metabolismo del azufre o del tiosulfato. Sin embargo, considerando la proximidad al gen p21 a genes que codificarían para un sistema de transporte de sulfato o tiosulfato, los elevados niveles de sintesis de P21 en azufre, tiosulfato, pirita y otros sulfuros, su posible localización asociada a la membrana interna pero hacia el lado periplásmico, y su similitud a rodanasas, la proteína P21 está probablemente involucrada en la oxidación o en la adquisición de compuestos azufrados.

Acidithiobacillus ferrooxidans (ex Thiobacillus ferrooxidans) is an acidophilic chemolithoautotrophic bacterium that obtains its energy from the oxidation of ferrous iron, elemental sulfur, or partially oxidized sulfur compounds. The ability of these and other microorganisms present in the same habitat to solubilize metal sulfides has been successfully applied in biomining operations. Two mechanisms have been proposed for the dissolution of metal sulfides, the direct one and the indirect one. In the direct mechanism, the bacteria directly oxidize the mineral by biological means, without any requirement for ferric or ferrous ions. Recent evidence favors the indirect mechanism of sulfide dissolution by which metal sulfides are degraded by a chemical attack of Fe(III) ions and/or protons on the crystal lattice. The mechanism of degradation is determined by the mineral structure. According to the proposed model, the disulfide pyrite (FeS2) and other similar sulfides are degraded by generating thiosulfate as the main intermediate. Iron(III) ions are the exclusive oxidizing agents for the dissolution. This explains why only Fe(II) ion-oxidizing bacteria are capable of oxidizing these metal sulfides. Metal sulfides such as sphalerite (ZnS), among others, are degradable by iron(III) ion and proton attack. As a consequence, polysulfides and elemental sulfur are the main intermediates. Because thiosulfate is the key compound in the oxidation of the sulfur moiety of pyrite, the mechanism has recently been defined as the thiosulfate mechanism. All reactions comprising this mechanism have been shown to occur on a purely chemical basis. However, sulfur compounds oxidizing enzymes such as the thiosulfate dehydrogenase of A. ferrooxidans may be involved. In addition, enzymes for thiosulfate or sulfite oxidation from A. ferrooxidans may succesfully compete with the chemical reactions with iron(III) ions as an oxidizing agent. A rhodanese activity has been previously described in A. ferrooxidans. This enzyme is a thiosulfate sulfur-transferase or rhodanese which breaks the S-S bond present in thiosulfate, generating sulfur and sulfite. The rhodaneses catalyze the transfer of a sulfane sulfur atom from thiosulfate to cyanide. We have previously studied the global changes in gene expression of A. ferrooxidans ATCC 19859 when the microorganism is grown on ferrous iron or sulfur and have identified some of these proteins. To further define some of the components involved in the oxidation of thiosulfate and metal sulfides, during this thesis we analyzed by means of 2D NEPHGE and Western blot the proteins synthesized by the bacterium when grown on Fe(II) ions, elemental sulfur, pyrite, thiosulfate, ZnS and CuS. We analyzed the synthesis of a P21 protein of 21 kDa whose synthesis was greatly induced when the microorganisms were grown in FeS2, thiosulfate, elemental sulfur, CuS, and ZnS and was almost completely repressed by growth in ferrous iron. After we determined the N-terminal amino acid sequence of P21, we used the available preliminary genomic sequence of A. ferrooxidans ATCC 23270 to isolate the DNA region containing the p21 gene. The nucleotide sequence of this DNA fragment contained a open reading frame (ORF) coding for a putative 23-kDa protein. This difference in size was due to the presence of a possible signal peptide. When p21 was cloned and overexpressed in Escherichia coli, the signal peptide was removed, resulting in a mature protein with a molecular mass of 21 kDa. P21 exhibited significant similarity to thiosulfate-sulfur transferases whose activity has been demonstrated in vitro. P21 also contained the highly conserved structural domains CH2A, CH2B and the catalytic site, typical of thiosulfate sulfur-transferases. However, the purified recombinant P21 protein did not show rhodanese activity. Unlike cytoplasmic rhodaneses, P21 was located in the periphery of A. ferrooxidans cells, as determined by immunocytochemical analysis, and was regulated depending on the oxidizable substrate. The genomic context around gene p21 contained other ORFS corresponding to proteins such as thioredoxins and sulfate-thiosulfate binding proteins. These results suggest the involvement of P21 in inorganic sulfur metabolism in A. ferrooxidans. Although yet to be demonstrated, this protein may be an important part of the indirect thiosulfate mechanism of dissolution of minerals and/or sulfur metabolism in A. ferrooxidans. By using the same reverse genetic strategy, we identified the gene coding for a putative sulfate-thiosulfate binding protein of 33 kDa (P33) whose synthesis increased during growth of the bacteria in thiosulfate in comparison with ferrous iron. The p33 gene was located upstream of the p21 gene. The presence of rhodanese activity detected in cell-free extract from A. ferrooxidans suggested the existence of a rhodanese-like gene in the genome. Using bioinformatic tools, we encountered a such a gene potentially coding for a 14 kDa protein (p14). We have cloned and partially characterized this protein. The recombinant P14 from A. ferrooxidans was functional when expressed in E. coli. In addition, A. ferrooxidans appears to have at least two more genes coding for rhodanese-like proteins. These proteins most likely perform other functions in the cell. At this point it is not possible to assign a definitive role to P21 in sulfur or thiosulfate metabolism in A. ferrooxidans, due to the lack of an appropriate workable genetic system to perform functional genomics with A. ferrooxidans. However, given its proximity to genes encoding the sulfate-thiosulfate transport system, its specific and high level of accumulation in pyrite, sulfur, thiosulfate, and other sulfides, its possible localization bound to the inner membrane but facing the periplasmic space, and its similarity to rhodaneses, the protein is probably involved in the oxidation or in the acquisition of sulfur compounds.